VPA解除Met对大鼠皮质神经元GAD表达的抑制(2)

2014-07-05 01:10

导读：1 材料与方法 1.1 试剂多聚左旋赖氨酸，N2添加剂(100×的成分: 牛胰岛素500μg/ml，人转铁蛋白10000μg/ml，黄体酮0.63μg/ml，硒0.52μg/ml，腐胺 1611μg/ml，Gibco)，基

1 材料与方法

1.1 试剂多聚左旋赖氨酸，N2添加剂(100×的成分: 牛胰岛素500μg/ml，人转铁蛋白10000μg/ml，黄体酮0.63μg/ml，硒0.52μg/ml，腐胺 1611μg/ml，Gibco)，基础培养液（DMEM、碳酸氢钠、青霉素、链霉素），胎牛血清，兔抗GABA 血清(1∶600)，羊抗兔IgG (1∶40)，免疫组织化学试剂盒，Met、Gly 标准品，苯甲基磺酰氟(PMSF)，非变性条件下裂解细胞的裂解液（pH 7.0的20mM Tris，150mM NaCl，1% Triton X-100，焦酸钠，β-甘油磷酸，EDTA，Na3VO4，等），GABA (纯度99.9 %)，5′-磷酸吡哆醛(PLP)，L-谷氨酸钠 (L-MSG)，次氯酸钠，Folin－酚试剂，牛血清白蛋白，巯基乙醇，重蒸酚，无水乙醇等。

1.2 动物孕期16～18天清洁级SD大鼠，由郑州大学动物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 大鼠皮质神经元分组培养大鼠皮质神经元的体外培养参照陈丽敏［5］完全培养液组的培养方法。以5×105/孔的数量接种大鼠皮质神经元于多聚左旋赖氨酸处理过的24孔培养板。以新配制的完全培养液(基础培养液 N2添加剂 10%胎牛血清)培养细胞，3天后换以无血清培养液（基础培养液 N2添加剂）分组继续培养。实验分三组，每组8个孔:空白组，无血清培养液；Met组，无血清培养液含终浓度为2mM的MET，培养3天后换以无血清培养液；VPA组，无血清培养液含终浓度为2mM的Met，培养3天后换以终浓度为0.5mM的VPA的无血清培养液。将细胞放置于温度37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。分组培养6天后将细胞用于各类实验。

1.3.2 GABA能神经元的免疫细胞化学(PAP法)鉴定培养细胞用4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100和0.03% H2O2/甲醇溶液于室温下处理30min，羊血清蛋白(1∶50)37℃ 1h，经兔抗GABA血清(1∶600)4℃孵育72h，再经羊抗兔IgG(1∶40)37℃ 1h，兔抗PAP复合物(1∶40)37℃ 1h，用DAB 4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)呈色35min，贴片、脱水、透明及封片。上述每步骤间均用PBS充分洗涤，光镜下观察。

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1.3.3 谷氨酸脱羧酶活性的测定（1）粗酶提取液的制备：去除培养液，用PBS、生理盐水（含最终浓度为1mM的PMSF）洗一遍细胞。每孔加入100μl非变性条件下裂解细胞的裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。裂解液接触细胞2s后，细胞就会被裂解。于4000r/min 下离心5min，得到的上清液即为粗酶液。裂解细胞的所有步骤都在冰上进行。采用Lowry 法测定蛋白质浓度后，用磷酸盐缓冲液稀释到3g蛋白/L。冰箱短时间保存备用。（2）采用比色法测定粗酶提取液谷氨酸脱羧酶的活性：取0.2ml 50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 6.8)，其中含5mmol/L L-MSG及0.2mmol/L 的PLP，加入0.1ml 待测粗酶提取液和0.1ml 蒸馏水（对照组加入0.1ml 2mM的Met，实验组加入0.1ml 2mM的Gly），于37℃水浴中保温30min；迅速置于冰浴中止反应，加入0.2ml 0.2mmol/L pH 9.0 的硼酸缓冲液，1ml 6%的重蒸酚溶液，0.4ml次氯酸钠溶液，充分振荡；沸水浴10min 后，冰浴20min不断振荡，直至有蓝绿色化合物出现，然后加入2ml 60%的乙醇于645nm 下比色。以已知浓度的GABA 作对照。在上述测定条件下，以每分钟生成1μmol 的GABA 所需的酶量为一个酶活单位(U)。每组测定同时做3次重复，求平均值。

1.3.4 统计学方法全部数据以（x±s）表示，采用SPSS10.0 统计软件，平均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有显著性。