利用基因芯片分析孕妇外周血浆APC基因甲基化的(2)
2014-11-19 01:11
导读：本实验以妊娠不同时期APC基因启动区不同CpG位点甲基化模式为基础，通过基因芯片对其变化规律进行探索性研究，寻找出它们之间的差异，以期可以作为生
本实验以妊娠不同时期APC基因启动区不同CpG位点甲基化模式为基础，通过基因芯片对其变化规律进行探索性研究，寻找出它们之间的差异，以期可以作为生理或疾病状态的标志物，并进一步应用于无创性产前诊断。
1 资料与方法
1.1 研究对象 从2005年5月～8月在
东南大学附属中大医院妇产科进行产前检查的初孕妇中，随机选择82例作为研究对象，其中妊娠4～12周(早期)24例，13～27周(中期)24例，28～40周(晚期)24例，产后1周10例。年龄23～35岁，初孕，临床无感染征象，无其他产科合并症及并发症。同时随机选取未孕健康女性18例作为阴性对照组。
1.2 标本收集和处理 对所有研究对象抽取5ml外周血EDTA抗凝。在24h内，先1600g 离心10min初步分离血浆，再于16000g下离心10min，充分去除细胞碎片等，获得纯净的血浆样品，血浆DNA采用标准酚－氯仿方法提取。
1.3 血浆DNA的亚硫酸转化 取8μl 的DNA加双蒸水至20μl ，加3M的NaOH 2μl解链，42℃水浴15min。在每个样品中加入5M的对苯二酚/亚硫酸氢钠溶液360μl，50℃水箱孵育12～16h。DNA过柱纯化(prgmaga公司)。将DNA转移入新EP管中，加入3M的NaOH 5μl，水浴15min。醋酸钠、无水乙醇沉淀DNA。次日用30μl 的TE重新溶解。
1.4 APC基因的不对称PCR扩增 APC基因上游引物5’-GGGGTTAGGGTTAGGTAGG-3’，下游引物5’-AACTACACCAATACAACCACATA-3’。PCR反应体系：反应体积25μl，包括10×PCR buffer(有MgCl2) 2.5μl，10mmol/L Cy3-dNTP 2μl，10mmol/L上游引物0.5μl，10mmol/L下游引物2.5μl，模板DNA 1μl，5u/μl Taq酶 0.2μl，灭菌双蒸水18.5μl。PCR扩增条件：95℃ 3min预变性，94℃ 30s变性，57℃ 30s退火，72℃ 40s延伸，40个循环，72℃延伸8min，4℃保存。
1.5 基因芯片的制备 在洁净的载玻片上，用2ml 1.2%的琼脂糖溶液均匀的平铺在玻片表面，待其凝固后置于37℃烘干。使用前将其浸泡于0.1mol／L的NaIO4溶液中30min，再用蒸馏水洗片3次，每次5min，晾干后备用。在APC基因启动子区甲基化位点较多的区域设计了16个CpG位点(分布于5个探针)和一个阴性对照，6个探针点样于膜片上。探针固定后备用。
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1.6 芯片杂交 在各管中加入15μl的转化产物和15μl的杂交缓冲液，置于95℃水浴锅变性7min。将变性好的杂交液滴于玻片上的点样区，并用18mm×18mm盖玻片盖于其上，然后避光置于37℃杂交2h，分别用2×SSC 0.2% SDS液、0.1% SSC 0.2% SDS液、0.1% SSC液洗涤共10min，室温晾干后用ScanArray 5000 扫描仪扫描。
1.7 芯片扫描和结果判定 对芯片扫描得到Cy3 图像文件通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取基因表达的荧光信号强度值，用预先定的内参照基因(植物基因) 对Cy3 的原始提取信号进行均衡和修正；用stroppro2.0 软件分析Cy3 荧光信号的强度和比值。用以下3 个条件作为判定基因阳性表达的标准: (1)Cy3 阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的3倍，ratio 比值范围在2.7～3.3； (2) 阴性荧光信号值
