AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表(2)

　　1.4实时定量RT-PCR检测总RNA提取按照Trizol试剂说明书操作。取2μg总RNA按反转录试剂盒说明书合成cDNA。用实时定量PCR仪(美国MJResearch)检测mRNA的表达。定量PCR反应体系：SYBR Green Mix 7.5μL，引物各0.3μL，cDNA 1.0μL，加三蒸水补足至15μL。反应条件：94℃预变性5min，92℃变性15s，60℃退火并延伸1min，共40循环，72℃终末延伸10min。PCR产物于12g/L琼脂糖凝胶电泳FluorechemTM8900凝胶成像系统成像，以目的基因与内参照GAPDH积分吸光度的比值作为定量值进行统计分析。引物序列见表1。表1实时定量PCR的引物序列Tab.1Primers for RTQ-PCR基 因引物序列产物长度

　　1.5Western印迹

　　按文献报道方法[11]。取各组细胞，PBS洗2遍，加入细胞裂解液，收获蛋白质，4℃，12000r/min，离心15min，Bradford法测定浓度。取适量的蛋白质标本，100g/L丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上电泳，电压90V 30min，140V 60min。室温恒压100V维持90min。丽春红染色硝酸素纤维膜，观察蛋白转移结果。TBST洗膜：室温下10min。50g/L脱脂奶粉阻断：室温下轻摇60min。TBST洗膜：室温下10min×3次。抗原抗体免疫反应加入TBST稀释的p47phox(1∶500)或GAPDH(1∶1000)抗体孵育：4℃摇床轻摇过夜。TBST洗膜：室温下10min×3次。分别与辣根过氧化物共轭的抗-兔的Ⅱ抗(1∶1000)及HRP-anti-biotin抗体(1∶1000)室温下孵育1h。TBST洗膜：室温下10min×3次。显影、检测ECL发光。室温下将膜浸于发光剂中1min后，取出膜甩去多余液体，将硝酸素纤维膜置于两张干净的保鲜膜之间，在暗室中对着X-线胶片曝光0.5～30min不等。胶片投入自动洗片机中冲洗和烤干。于凝胶成像系统进行目的蛋白及内参照GAPDH条带灰度分析。

　　1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行分析。吸光度分析采用单位面积计算机图像扫描值减去背景值的均值表示信号强度，以GAPDH作为内参照，计算两者吸光度的比值，并以对照组或0h组作为基准，计算其他各实验组相对吸光度值，以±s表示。组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1大鼠腹膜间皮细胞的鉴定培养的大鼠腹膜间皮细胞呈菱形、椭圆形、多边形等，细胞融合后，呈典型的铺路石样。免疫组化结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性。在AngⅡ10-7mol/L浓度作用12h后，RPMCs失去原来的整齐排列，细胞间隙增宽，但细胞形态未出现明显的改变(图1)。图1腹膜间皮细胞的形态Fig.1 Morphology of peritoneal mesothelial cells (×200)A：正常大鼠腹膜间皮细胞的形态;B：血管紧张素Ⅱ刺激后大鼠腹膜间皮细胞的形态。

　　2.2AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用激光共聚焦显微镜观察DCF荧光强度代表ROS产生的量。正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)，在DCF孵育20min后，ROS的产生情况如图所示(图2)。统计学分析，腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激20min后，ROS产生较A组显著增加(P<0.05)。C组、D组均可显著逆转由AngⅡ刺激诱导的ROS产生增加，与B组比较，均差异显著(P<0.05)。C组与D组相比较差异显著(P<0.05)，说明ROS产生的量与AGI的浓度呈负相关(图3)。图2激光共聚焦显微镜DCF荧光Fig.2 DCF fluorescent model under laser confocal microscopeA：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)。图3AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用Fig.3 Angiotensin Ⅱ influenced ROS production and effect of astragalus intervention (n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组。A vs. B，P<0.05;B vs. C，P<0.05;B vs. D，P<0.05;C vs. D, P<0.05。

　　2.3AngⅡ对NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用实时定量RT-PCR结果显示，AngⅡ可诱导NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达上调，且以时间依赖模式上调，p47phox mRNA从4h开始有统计学差异(P<0.05)，至12h到达峰值(图4)。Western blot结果显示，AngⅡ可诱导p47phox蛋白表达以时间依赖模式上调，从12h开始有统计学差异(P<0.05)，至48h达峰(图5)。图4AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA的表达情况Fig.4 Ang Ⅱ induced NADPH oxidase subunits p47phox mRNA expression (n=4)4、8、12、24h vs. 0h，P<0.05。　　图5AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白的表达情况Fig.5 Ang Ⅱ induced NADPH oxidase subunits p47phox protein expression (n=4)　　12、24、48、72h vs. 0h，P<0.05。PMCs经AGI预处理后，再行AngⅡ体外刺激，可显著逆转由AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达上调，C组、D组分别与B组比较，具有显著差异(P<0.05)，但未观察到C组与D组有显著性差异，AGI对p47phox mRNA表达的抑制度不依赖浓度模式(图6)。图6AGI预处理可显著逆转AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达的上调Fig.6 AGI pretreatment could reverse Ang Ⅱ’s induction of NADPH oxidase subunits p47phox mRNA expression(n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组;A vs. B，P<0.05;B vs. C，P<0.05;B vs. D，P<0.05。

　　3讨论

　　腹膜纤维化是腹膜透析的重要并发症之一，对其发病机制的不断探讨、寻找新的治疗靶点及有效干预剂是腹膜透析进一步发展的迫切需要。AngⅡ不仅作为一种血管活性物质参与RAS的活化效应过程，而且局部产生的AngⅡ作为一种重要的生长因子参与调节细胞的增值、凋亡及纤维化进程，是引起腹膜纤维化的重要因子之一[10-12]。NADPH氧化酶是一种过氧化物酶, 广泛存在于吞噬细胞及非吞噬细胞，其催化产物活性氧( reactlve oxygen species, ROS) 参与机体防御和信息传递等许多生理过程。NADPH氧化酶主要由5个亚基组成，包括2个膜亚基：gp91phox、p22phox;3 个胞浆亚基：p47phox、p40pox、p67phox。另外，还有2个低分子量的GTP结合蛋白Rap1A和rac2。当细胞受到相应刺激后, 胞浆亚基p47phox被磷酸化激活，与p67phox结合并向胞膜转位，与胞膜亚基结合组成有氧化活性的复合体，将氧催化为-O2-，进而产生一系列活性氧，造成细胞损伤。NADPH氧化酶作为ROS的调控酶，其胞浆亚基p47phox在多种组织的氧化应激反应中起着始动、枢纽性作用[13-15]。如前所述，色谱指纹图谱证实黄芪注射液有稳定的清除自由基、抗氧化的色谱峰，其拮抗高糖环境对腹膜间皮细胞的氧化应激损伤的作用已被证实。该实验研究中，在AngⅡ作用下，ROS的产生明显增加，腹膜间皮细胞NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA和蛋白结果一致，均呈时间依赖模式的表达上调。我们应用黄芪注射液预处理后发现，黄芪不仅可明显减少由AngⅡ诱导的腹膜间皮细胞ROS的产生，而且可使NADPH氧化酶亚基p47phox的表达降低。该实验表明黄芪不仅能够抑制NADPH氧化酶的表达，而且可抑制其活性。 由此我们推测，黄芪通过抑制腹膜间皮细胞NADPH氧化酶的表达及其活性，从而减少腹膜间皮细胞ROS的产生，阻断ROS在其中的信号传导作用，及下游因子TGF-β的过度表达，减轻细胞的转分化和细胞外基质的积聚，增加细胞外基质的降解而发挥其延缓腹膜纤维化的作用。

　　综上所述，长期腹膜透析患者，腹膜间皮细胞暴露于腹透液高糖、低pH值、乳酸盐和葡萄糖降解物GDP等多种生物不相容因素下，可导致腹膜纤维化，AngⅡ、ROS、NADPH氧化酶均参与其中。腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激，其ROS产生明显增多。ROS产生增多与其调控酶——NADPH氧化酶的表达上调密切相关。黄芪注射液能够抑制NADPH氧化酶的表达，减少腹膜间皮细胞ROS的产生，从而减少腹膜的氧化应激损伤，延缓腹膜纤维化的发生发展。

【参考文献】