神经营养因子家族及其受体在重组人骨形态发生(2)
2014-05-06 01:18
导读：骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）能诱导未分化间充质细胞不可逆地分化形成骨和软骨，在骨折愈合和骨修复过程中发挥着重要作用。研究表明
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）能诱导未分化间充质细胞不可逆地分化形成骨和软骨，在骨折愈合和骨修复过程中发挥着重要作用。研究表明，在骨折愈合中，除了BMP的诱导成骨作用外，尚有其他众多因子的表达和参与，如TGFβ、VEGF、IGFI和bFGF等，以促进新骨的形成和成熟。神经营养因子（neurotrophic factors，NTFs）家族在中枢和外周神经元的生长、发育、分化和维持正常存活中起着重要的作用〔1〕。NTFs及其受体Trk在全身广泛分布，并在骨折愈合过程中有明显的表达〔2〕，外源性NGF具有促进骨折愈合的作用〔3〕。但是在外源性BMP诱导成骨过程中是否也有NTFs及Trk的表达尚未见报道。本文对rhBMP2异位诱导成骨过程中NTFs、Trk的表达和NTFs mRNA的表达规律的研究进行报道。
1 材料和方法
11 动物和材料
雄性ICR小鼠36只，体重20~22 g。实验使用的rhBMP2胶原复合诱导材料（骨诱导，含rhBMP 2025mg／片）和胶原海绵均由华东基因技术研究所提供。NTFs及TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，RTPCR试剂盒购自宝
生物工程（大连）有限公司。
12 动物实验模型
将36只ICR小鼠随机分为实验组和对照组，每组18只。氯胺酮腹腔注射麻醉，取rhBMP2复合材料1／2片（含0125 mg rhBMP2）植入实验组小鼠右侧股后部肌间隙中，对照组小鼠植入相同大小胶原海绵。两组分别于术后第7、14和21 d各处死6只小鼠取材，分别进行组织学、免疫组织
化学检测和NTFs mRNA的RTPCR检测。
13 检测项目
131 组织学观察
标本采用4％多聚甲醛固定24 h，第14及21 d所诱导骨组织需采用10％EDTA脱钙液脱钙，充分水洗，逐级脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，3μm连续切片，行HE染色，光镜下观察。
（科教作文网http://zw.NSEaC.com编辑发布） 132 免疫组化染色（SABC法）
石蜡切片经脱蜡入水后，3％H2O2 甲醇灭活内源性过氧化氢酶，正常羊血清封闭，采用SABC法进行免疫组化染色。抗原经微波热修复后，分别滴加NGF、BDNF、NT3和TrkA、TrkB、TrkC兔抗小鼠多克隆抗体（工作液浓度为1∶200），室温下孵育2 h。生物素化山羊抗兔IgG及SABC复合物各孵育30 min，各步骤间均采用001 mol/L PBS洗涤。以二甲基联苯胺（DAB）显色，阳性显示为棕色，苏木素轻度复染。
