灵芝孢子能够调节妊高征大鼠所生幼鼠 海马线粒(2)
2014-06-29 01:03
导读:1.4 放射免疫法检测cAMP水平 每只幼鼠海马组织称质量后,放入盛有2 ml冷冻醋酸缓冲液 (50 mmol/L, pH 4.75)的试管内,在冰上匀浆后加入 2 ml 无水乙醇,混
1.4 放射免疫法检测cAMP水平 每只幼鼠海马组织称质量后,放入盛有2 ml冷冻醋酸缓冲液 (50 mmol/L, pH 4.75)的试管内,在冰上匀浆后加入 2 ml 无水乙醇,混匀,静置5 min,3 500 r/min离心 15 min, 离心半径为16.3 cm。60 ℃烘箱中烘干,4 ℃保存。测量时用1 ml醋酸缓冲液溶解后取 0.1 ml 检测。检测步骤及结果计算按照试剂盒要求操作。cAMP放免试剂盒购自
上海中医药大学核医学实验室。
1.5 RT-PCR检测相关基因转录 P0和P30幼鼠中各收集3例分离海马组织。将获取的每只幼鼠海马组织,按照Trizol试剂(北京赛百胜公司)说明一步法提取组织总RNA。取2 μl RNA经RT反应体系作用,在下列条件下合成cDNA:70 ℃ 5 min, 42 ℃ 60 min,94 ℃ 5 min。取RT产物1 μl对如下引物进行PCR。Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha (pgc1α)引物序列为:上游引物,5'cacagattcaagccagtgctac3';下游引物,5'cggagagttaaaggaagagcaa3'。tfam引物序列为:上游引物,5'gaaacgcctaaagaagaaagca3';下游引物, 5'aagtccatgggctacagaaaaa3'。 GAPDH引物序列为:上游引物,5'aacaagtaaccctcaaccctg3';下游引物,5'acac-cctctgatacccacatt3'。PCR反应程序:94 ℃预变性2.5 min。然后进入以下29个循环:94 ℃变性45 s,54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min。循环完毕,72 ℃延伸5 min中止反应。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统拍照,ImageTool软件进行目的条带光密度分析。
1.6 mtDNA水平测定 将获取的每只幼鼠海马组织,按照试剂盒(上海杰美基因公司)说明提取DNA,并按照如下引物应用PCR分别扩增COX3、COX4和GAPDH。COX3引物序列为:上游引物, 5'atgaccactaacaggagcccta3' ;下游引物,5'taggggattta-aaggggtgatt3'。COX4引物序列为:上游引物, 5'ggactcagaactcaagggaca