论分离方法对移植卵巢卵泡发育的影响(2)
2014-07-28 01:14
导读：1.4.3 C组(短时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3块，置于500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化，每隔5 min即从培养箱
1.4.3 C组(短时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3块，置于500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化，每隔5 min即从培养箱中将组织取出，用200 μL移液枪吹吸消化液30次，在体视显微镜下观察是否有游离的卵泡，如有则将卵泡迅速转移至装有1 mL新鲜培养液的35 mm培养皿中。共消化20 min。
1.4.4 D组(结合法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切成3块，转移至500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化5 min。然后在带有37 ℃恒温热盘的体视显微镜下，在卵泡酶解液中用精细尖镊分离卵泡。每分离5 min，即将已分离得到的完整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中。共分离4次，20 min。
1.5 双荧光染色 每组随机选取部分分离卵泡，放入Calcein AM(4 mmol/L，Sigma，C1359)和Ethidium Homodimer睮(10 mmol/L，Sigma，E1903)混合液中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养45 min;卵泡悬液置倒置荧光显微镜观察，在蓝光的激发下，活的卵泡发绿色荧光，死的卵泡发红色荧光，分别计数死、活卵泡数。
1.6 卵泡体外培养 各组分离所得卵泡分别进行体外培养12 d。第0天，分离得到的卵泡培养在加有1 mL培养液的35 mm培养皿中;第1天，加入1 mL新鲜培养液;此后每天半量换液;第12天全量换为卵泡成熟培养液(α睲EM，5黃，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1% ITS，1.5 IU/mL hCG);第13天，在加入卵泡成熟培养液后26 h收集排出的卵丘复合体(OGCs)。
1.7 体外受精 每组的OGCs分别行体外受精。卵母细胞受精培养4 h后从受精滴中洗出，转移至预先平衡过的KSOM AA的小液滴中培养。观察卵母细胞的成熟率(以含有第一极体的卵母细胞百分率代表)、受精率(以双原核卵母细胞占有第一极体卵母细胞的百分率代表)。
1.8
统计学处理 采用SPSS 11.5软分析。4组的卵泡存活率、培养卵泡各阶段成熟率、排卵率运用单因素方差分析(one way ANOVA)，各组均数以最小显著差法(least significant difference
