PTTG、VEGFC 的表达及微淋巴管密度与非小细胞肺癌(2)
2015-05-12 01:13
导读：13 实验方法 131 实时荧光定量 1311 总RNA的提取 每100 mg组织匀浆后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入02 ml氯仿，离心后吸取上清，加入05 ml异丙醇，离心沉淀后
13 实验方法
131 实时荧光定量
1311 总RNA的提取
每100 mg组织匀浆后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入02 ml氯仿，离心后吸取上清，加入05 ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，75% 乙醇洗沉淀，DNase Ⅰ酶解可能残余的基因组DNA。RNA 溶于DEPC 水，甲醛变性凝胶电泳，分光光度计检测浓度和纯度。
1312 cDNA的合成
反转录仪为 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司)。采用10 μl反转录反应体系，4μl 溶解于去RNA酶的双蒸水，05μl 随机引物（100 μmol），2 μl 5×ExSciptTM Buffer，025μl ExSciptTMRTase（200 U/μl），025 μl RNA酶抑制剂（40 U/μl），05μl dNTP 混合物(各10 mmol)，加去RNA酶的蒸馏水至10μl。反应条件：42 ℃15 min（反转录反应）；95℃2 min（反转录酶的失活反应）。
1313 荧光定量PCR扩增
引物：由TaKaRa公司提供的高特异性引物, PPTG 上游引物序列5′睠CTCAGATGAATGCGGCTGTTA3′，下游引物序列5′睞GCTTCAGCCCATCCTTAGCAA3′，扩增片段为118 bp。VEGF睠 上游引物序列5′CAGCACGAGCTACCTCAGCAAG3′，下游引物序列5′睺TTAGACATGCATCGGCAGGAA3′，扩增片段为115 bp。荧光定量 PCR 仪为ABI PRIS
