浅析蓝藻生物工程(2)
2013-07-14 01:18
导读：① Taq酶活力的有无、高低直接关系着扩增结果。Taq酶的用量一般为0.5一3.0U。Taq酶的活力过高可能导致非特异性扩增，过低则酶活不足而导致扩增条带太弱
① Taq酶活力的有无、高低直接关系着扩增结果。Taq酶的用量一般为0.5一3.0U。Taq酶的活力过高可能导致非特异性扩增，过低则酶活不足而导致扩增条带太弱。
② Mg2+主要作用是作为Taq酶的辅助因子，其浓度过低或过高都会影响Taq酶的活性。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低;浓度过高对酶也有抑制作用。较低的Mg2+浓度扩增有较高的特异性，过高会导致非特异扩增产物的积累，背景模糊。
③ 变性温度过低，不能使靶基因模板和PCR产物完全变性，就会导致PCR扩增失败。变性温度一般在92一95℃，更高的温度可能更有效，尤其对富含G一C的片段，但Taq酶在95℃可保持活力35min左右，高温变性时间过长会导致Taq酶活力降低。
退火温度决定了反应的特异性。在一定范围内，退火温度越高，PCR扩增特异性越高;但退火温度过高，引物与模板DNA亲和力太小甚至不能结合，会导致扩增产物量降低。
延伸温度:现有的Taq酶最佳活力温度范围是65一75℃，一般72℃时酶活力最高。因此在扩增反应中，延伸温度采用72℃。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，而目.也会影响其产量。延伸时间取决于靶序列的长度和浓度，延伸时间过长会导致非特异性带的出现。
④ 循环次数决定扩增程度。在其他参数己优化的条件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓度，过多的循环增加非特异性扩增的数量和复杂性(平台效应);循环次数太少，PCR产物量就会极低，扩增带太弱甚至扩增阴性。PCR一般采用25一45个循环进行扩增
6. PCR扩增时若操作不严格，很可能导致假阴性和假阳性结果
假阴性主要是模板液中某些物质，如残留的极少量培养液成分、菌体蛋白等抑制了PCR反应;或者是pCR体系液中某成分失效所致，如dN丁P反复冻融降解、Taq酶活性下降、引物部分降解等都可能导致假阴性的结果。
（科教作文网http://zw.ΝsΕAc.com发布）
假阳性的造成，前人认为主要是扩增产物污染和标本间的交叉污染。扩增产物污染既是最严重，也是最容易发生的一种污染。因为经过一次标准的PCR扩增，就可以产生大量的扩增产物，即使最微小的气溶胶微滴(10一6uL)，也可含有大量的靶分子。
由于PCR具有极高的灵敏性，在试验设计中，研究人员们注意选用较低的Mg2十浓度和引物浓度、较高的退火温度，可以一定程度上防止非特异性扩增和假阳性的产生。假阳性的原因在于核酸污染，而核酸污染来自两方面:扩增产物污染以及样品间DNA交叉污染。目前报导的解决扩增产物污染方法有两种:尿嗯陡一N一糖基化酶解法和8一甲氧补骨酷素光化学法。但这两种方法并不能防止样品间DNA交叉污染。为了尽量避免假阳性的出现，规范实验程序可能更有实用价值，从实验条件到操作上都严格要求
参考文献
[1] 张占会,谢数涛,韩博平,林少君,钟秀英,林桂花. 全细胞多重PCR检测蓝藻—微囊藻及产毒微囊藻方法初探[J]. 生态科学, 2005, 24(1):31~4.
[2] 施定基. 蓝藻分子生物学和基因工程研究在我国的发展[J].中国科学院植物研究所.北京100093
[3] 黄家权,王高鸿,李敦海,刘永定,尹黎燕. 全细胞PCR扩增用于鱼腥藻种类鉴定[J]. 水生生物学报, 2004,(02).
[4] 潘卉,宋立荣,刘永定,朱运芝,沈强. 水华蓝藻产毒特性的PCR检测法[J]. 水生生物学报, 2001,(02).
[5] 陈颖,李文彬,孙勇如藻类基因工程的研究技术及方法[J]. 植物学通报.1999,16(4):321~331.
[2]
