1 引言 柑桔溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致(2)

　　2.2.5 阳性克隆的菌落PCR 鉴定及酶切鉴定
　　分别挑取 10 个轻链库及 Fab 库阳性克隆，经 PCR 初步鉴定后再分别用 SacⅠ/XbaⅠ及 SpeⅠ/XhoⅠ 双酶切鉴定其重组率。

　　3. 结果与分析
　　3.1 总RNA 的提取
　　对提取的总RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中总RNA 电泳条带以28S rRNA 和18SrRNA 为主，用分光光度计测得总RNA 的OD260 / OD280 的比值为1. 8，浓度约为1μg/μL，显示总RNA 质量好，无降解，符合试验的要求。

　　3.2 轻链和重链Fd 段基因的扩增
　　以 cDNA 第一链为模板，分别以轻链和重链Fd 段基因的3′端引物和5′端引物进行PCR 反应，分别扩增出轻链和Fd 段。将PCR 产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，显示在约680 bp 处可见明显的扩增条带(如图2)，与理论值相符。M 为DNA 分子量标准MarkerⅡ, 1-7 分别为轻链基因的PCR 产物，8-10 分别为重链基因的PCR 产物。

　　3.3 轻链基因库的构建
　　1μL 轻链重组噬粒的转化细菌菌液铺板克隆数为 1009 个，测定转化效率为1×106，通过菌落PCR 法鉴定轻链重组质粒，电泳结果显示 10 个克隆在680 bp 处都有条带，均判定为阳性克隆，用SacI 和XbaI 对重组噬粒进行酶切反应再次验证，酶切后产物电泳发现10 个克隆均有约4 kb + 680 bp 两个条带，判定为阳性克隆(如图3)，由此计算重组率约为100%。

　　3.4 噬菌体Fab 抗体库的构建
　　1μL 含抗体Fab 片段基因的重组噬粒转化细菌菌液铺板有2006 个克隆子，计算出转化率约为2×106。随机挑取10 个转化后的克隆子，通过菌落PCR 法鉴定，其中有8 个菌落扩增出680 bp 的片段，判定为阳性克隆，用XhoI 和SpeI 对重组噬粒进行酶切反应再次验证，酶切后产物电泳发现8 个阳性克隆均切出4 kb + 680 bp 两个条带，判定为阳性克隆（如图 4），由此计算重组率约为80%，库容量为1.6 ×106。经过辅助噬菌体VCSM13 的超感染，在PEG 沉淀浓缩后，得到的上清即是噬菌体抗体库，测得噬菌体抗体库滴度为2.4×1011 cfu。

　　4 讨论

（转载自http://zw.ＮＳＥaＣ.com科教作文网）

　　在本研究中采用柑桔溃疡病菌免疫的小鼠为建库源，从理论上来说，已包含抗柑桔溃疡病菌的各种抗体基因，而且在构建噬菌体抗体库时，抗体重链基因和轻链基因之间的随机组合进一步丰富了抗体对抗原识别的多样性。 有研究表明，107个特异性抗体分子就能识别全部抗原决定簇的99%， 构建一个库容为108 的组合噬菌体抗体库，一般可以认为基本上包括了所有的抗体分子。目前所构建的各类抗体库，库容一般介于106-108[10]，我们构建的抗体库，库容为1.6×106，滴度为2.4×1011 cfu，基本达到建库要求，能满足多样性的要求[11]。在以pComb3XSS为载体的噬菌体展示系统中，克隆位点下游含有有一个能够编码6个组氨酸的His-tag 序列，该序列可作为蛋白标签来进行目的蛋白的检测和纯化，还含有一个琥珀终止子，在非琥珀抑制型的大肠杆菌中只表达目的蛋白，为后期的纯化工作带来方便。

　　构建过程中的诸多环节都可影响抗体库的质量，载体的转化效率是制约抗体库容量和丰富性的重要因素之一。一般研究中都采用电穿孔法将重组DNA转入宿主菌， 其转化效率最高可达109-1010转化子/μg DNA，但是如果在培养液中使用抗生素，电穿孔的转化效率会显着降低3-5个数量级。本研究中我们制备了超级感受态进行化学转化，运用该方法一般情况下可以获得2×108或者更高的转化效率，比常规的CaCl2转化法要高出2-3个数量级。在我们的实际应用两次转化中获得了106-107的较好转化效率，且转化的结果比较稳定。抗体基因的扩增是影响库容量的另一个重要因素，其中轻链比较容易扩增，在56-58℃均可扩增出比较亮的目的条带，但是重链Fd段的扩增相对困难一些，而且产率也没有轻链基因的高，这可能与重链基因相对复杂有着重要关系。在克隆过程中，为尽量减少对重链基因的操作，增加抗体库的多样性，采用先连接轻链基因，后连接重链Fd段。