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2·1 急性运动或AICAR注射AMPK活性的变化
和安静对照组相比,一次大强度运动后即刻,腓肠肌AMPK活性升高180%(P<0·01),2 h组和1 h相比显著下降,但仍高于对照组(P<0·01),6 h恢复到对照组水平。和生理盐水注射对照组相比,一次AICAR注射后1 h,腓肠肌AMPK活性升高62%(P<0·01),2 h时基本恢复(与对照组相比无显著差异,P>0·05),6 h时完全恢复。表2 急性运动或AICAR注射腓肠肌AMPK活性的变化对照组(Control, n=8)即刻取材组(n=6)1 h取材组(n=6)2 h取材组(n=6)6 h取材组(n=6)急性运动3·18±0·29 8·60±0·75**5·41±0·63**$$- 3·12±0·34AICAR注射3·11±0·33 - 5·03±0·57**3·63±0·46 3·29±0·36
注:结果为平均数±标准差(X±SD)。**表示与对照组相比有非常显著性差异,P<0·01。$$表示与即刻相比,有非常显著性差异,P<0·01。
2·2 急性运动或AICAR注射mTOR、4E-BP1、P70S6K1磷酸化水平的变化 和安静对照组相比,一次大强度运动后各目标蛋白检测位点的磷酸化相对含量(和actin比较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在运动后即刻下降45%(P<005),2 h开始升高,6 h时进一步升高(增加87%,P<0·05);4E-BP1 Thr37/46在运动后即刻下降34%(P<0·05),2 h时增加1·4倍(P<0·01),6 h时进一步升高(增加2·4倍,P<0·01);S6K1Thr389在各时间点分别增加42%、52%和57%(P<0·05)。
注:结果为平均数±标准差(X±SD)。*表示与安静对照组相比有显著性差异,P<0·05;**表示有非常显著性差异,P<0·01。和一次生理盐水对照组相比,一次AICAR注射后各目标蛋白检测位点磷酸化相对含量(和actin比较的相对灰度值)变化如下:mTOR Ser2448在注射后1 h下降38%(P<0·05),2h开始升高,但无显著性差异,6 h时进一步升高(增加97%,P<0·05);4E-BP1 Thr37/46在注射后1 h下降38%(P<0·05),2 h时升高61%(P<0·05),6 h时进一步升高(增加188%,P<0·01);S6K1Thr389在各时间点均无显著变化(P>0·05)。
3 分析与讨论
3·1 急性运动或AICAR注射激活骨骼肌AMPK信号
5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5′-aminoimidazole-4-carboxam-ide ribonucleoside, AICAR)是目前应用较多的AMPK激活剂,它是腺苷的类似物,进入细胞后在腺苷激酶的作用下转化为单磷酸核苷(ZMP),ZMP是AMP的类似物,它能够变构激活AMPK和其上游激酶AMPKK,后者继而激活AMPK,此过程并不引起细胞AMP、ADP和ATP水平改变[6]。本实验结果表明,以0·5 mg/g剂量一次性皮下注射AICAR能显著激活骨骼肌AMPK,注射后1 h AMPK活性增加61%(P<0·01),2 h时仍略高于安静水平17%(P>0·05),但无显著性差异,6 h恢复正常。一次性大强度运动后即刻AMPK活性较安静时增加1·8倍,此后持续下降,但1h时仍高于安静水平,6h时已完全恢复正常。虽然无法比较运动和AICAR激活AMPK的效应,毕竟运动强度和时间与药物浓度之间尚无法进行对应,但本实验结果表明运动和注射AICAR均能有效激活骨骼肌AMPK,且恢复时程基本一致。不过,从本实验结果来看,二者仍表现出一些差异。其一,大强度一次性运动明显强于AICAR以0·5mg/g的剂量注射对AMPK的激活程度(数据显示如此)。事实上,运动和AICAR激活AMPK的机制是不相同的,前者主要通过AMP和ATP的作,后者则通过ZMP的作用。ZMP虽然是AMP的类似物,但其激活AMPK的方式可能与AMP不同。有人认为ZMP可能作用AMPK的外部机制如激活糖原磷酸酶等其他AMP敏感酶,或是经腺苷受体和/或腺苷转运体发挥作用[7-8]。ZMP是否也象AMP一样,通过增加上游激酶对AMPKαThr172位点磷酸化而激活AMPK也不清楚,而且,AICAR增加ZMP的同时, ZTP亦见增长,并通过变构效应妨碍AMPK的完全激活。所以,ZMP的作用逊于AMP,这可能是AICAR的作用不如运动强烈的部分原因。其二,AICAR注射大鼠注射后2 h AMPK已恢复正常,而运动大鼠在运动后2 h仍高于安静水平。所以,AICAR对运动的效应模拟也不是完全一致的。
3·2 一次AICAR注射或运动对mTOR信号通路的影响
不同运动形式对骨骼肌蛋白代谢的影响非常复杂。高频电击、抗阻运动能促进蛋白合成,造成净体重增加,剧烈或长时间耐力运动对蛋白代谢可能具有抑制作用。Bolster等发现,使用AICAR孵育使大鼠肝细胞蛋白合成速率明显下降[1]。使用AICAR诱导C2C12肌管AMPK激活发生于注射后第15 min,并在随后持续上升,相应地,在第15、30和60 min蛋白合成速率分别下降为注射前的90%、70%和63%[9]。实验表明,AMPK抑制肌细胞蛋白合成的机制涉及对mTOR信号通路的下调。本实验发现,一次AICAR注射后1 h,mTOR Ser2448、4E-BP1 Thr37/46磷酸化水平均下降38%,2 h时开始升高(分别