核酸疫苗与寄生虫核酸疫苗的研究进展(2)

　　1.1　核酸疫苗在骨骼肌细胞表达的外源抗原由抗原提呈细胞（APC）提呈　注射核酸疫苗后三天即可通过免疫组化方法检测到肌细胞表达的外源蛋白质抗原［9］，但肌细胞并不能表达激活T细胞所必需的第二信号-B7［10］，不能进行抗原提呈。动物实验结果表明，核酸疫苗在嵌合体小鼠诱导CTL应答受供骨髓小鼠MHC限制，嵌合体小鼠的骨骼肌细胞不能提呈抗原，只有供者骨髓细胞来源的APC才能提呈抗原［11］。对严重联合免疫缺陷BALB/c小鼠分别肌注HIV、HSV核酸疫苗，三周后移植CB6F1小鼠脾细胞和骨髓细胞，小鼠能产生H-2b和H-2d限制性CTL，证明骨骼肌细胞来源的抗原能被CB6F1小鼠骨髓细胞中的APC吞噬、加工、活化CTL前体细胞［12］。

　　1.2　核酸疫苗直接转染APC　以任何途径（皮肤、粘膜、肌肉等）接种核酸疫苗，都可能直接转染专业APC，如巨噬细胞、树突状细胞。核酸疫苗在APC内表达的蛋白质抗原作为“内源性抗原”，经胞浆内的蛋白酶降解成8～10个氨基酸组成的肽，被内质网膜上的抗原肽转运结构转入内质网腔，与MHCI类分子形成聚合体，经高尔基体到达APC膜表面，被T细胞的受体识别，这是诱导CTL应答最有效的途径。APC在肌肉组织分布较少，但极少量APC被转染即能诱导免疫应答，不到200个树突状细胞被核酸疫苗转染即可诱导抗体产生和CTL应答［13］。

　　1.3　核酸质粒的免疫佐剂功能　近年发现细菌DNA本身也是一种免疫佐剂，可有效地激活免疫效应细胞。介导这一作用是一类具有特征性的短核苷酸序列，被称作免疫刺激DNA序列（Immuno-stimulatory DNA sequence,ISS）［14，15］。对DNA 的分段研究分离出一些引起NK细胞激活的ISS，这些序列绝大部分是由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸为基元的寡聚体，其碱基排列大多遵循一种规律，这种特征性序列则称作为ISS［16］。ISS的发现以及对其生物学功能研究的不断深入，扩展了人们对DNA生物学功能的新认识。同时，对ISS的研究也有望提供一种高效、低毒、适用于人类的新型佐剂。研究发现氨苄青霉素抗性基因含两个ISS，而卡那抗性基因无此序列。将带氨苄青抗性基因的半乳糖苷酶表达质粒pACB-Z或pACS-Z皮内注射小鼠能诱导强的体液和CTL免疫应答，以卡那抗性基因置换氨苄青抗性基因构成pKCB-Z进行免疫所诱导的抗体效价明显降低，不能测及CTL应答。将pUC19、pACB、pKISS-CB-Z和含ISS的寡核苷酸分别转染人外周血单核细胞，可检测到干扰素， 干扰素、IL-12的表达增高三倍，而pKCB或无ISS的寡核苷酸则无此效应［15］。由于DNA疫苗可在机体内较长时间表达，局部形成抗原库，类似弗氏完全佐剂中矿物油存留抗原作用，同时质粒骨架中的ISS还可选择性地刺激Th1应答。因此，用于DNA免疫目的的质粒DNA(pDNA)从概念上可分为两个部分：①转录部分，指导相应的抗原蛋白在体内表达；②佐剂部分，辅助机体对抗原产生免疫应答。

　　1.4　核酸质粒的启动子　用于制备DNA疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，它在宿主细胞内的表达水平与调控DNA表达的启动子关系密切。不同的启动子在不同机体组织中表达的水平可以显著不同，而表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。目前常用的启动子为巨细胞病毒CMV早期启动子和猿猴病毒SV40的早期启动子。Cheng等将8种启动子所调控的质粒DNA分别接种于真皮、表皮、肌肉、肝脏和腹腔中，利用编码产物荧光素酶表达活性来检测各启动子的调控能力。结果显示只有CMV在所有5种组织中都有很高的调控能力；PL和PEP只在真皮中的表达水平与CMV相似；mMT在表皮中的表达水平较高；RSV和SV40除在真皮中表达水平较低外，其它部位均有较高的表达；而AD不管在哪种组织中的表达水平均较低［17］。Xiang等则专门比较了CMV和SV40早期启动子的调控水平，发现这两种启动子在体外实验中表达狂犬病毒糖蛋白的能力有着惊人的差异，CMV远高于SV40。如果通过小鼠的注射比较，这两种启动子调控的DNA疫苗却诱导出相似免疫效应。尽管在大多数哺乳动物细胞体外表达实验中，CMV早期启动子的转录效能高于SV40早期启动子，可在体内表达实验中发现，接种SV40启动子调控的质粒DNA表达糖蛋白的宿主细胞数目多于CMV启动子调控的质粒［2］。