反义核酸技术及其在寄生虫学中的应用进展(3)

　　3.1.3　AON不同靶基因对抗疟作用影响

　　AON对不同基因的抑制作用不一致，这和该基因在虫体代谢过程中是否起举足轻重作用密切相关。AON的抗疟研究主要集中在DHFR-TS基因，这固然与其在疟原虫核苷酸代谢中的特殊地位有关(见前述)。Barker等(1996)对恶性疟原虫耐药株多个靶基因的AON作用进行了比较研究，方法是将PS aON加入到疟原虫体外培养液中，培养48小时后，通过镜检和3氚-次黄嘌呤掺入试验观察AON对虫体的生长抑制作用。结果表明，抑制作用与AON浓度密切相关。当AON浓度为1μmol/L时，AON呈非特异性抑制；当浓度在0.5－0.005μmol/L范围时，以DHFR-TS、二氢喋呤合成酶、核苷酸还原酶、裂殖体多基因家族和红细胞结合抗原-175为靶的PS aON与对照组相比，均能特异地显著抑制虫体生长(P＜0.0001)，而DNA聚合酶α的PS aON抑制作用更弱，磷酸丙糖异构酶的PS AON抑制作用则与对照组相同。

　　疟原虫感染红细胞中，近75％血红蛋白被滋养体降解而形成大量对虫体有害的血红素，必须在消化泡中聚集成对虫体无毒的疟色素。研究表明，恶性疟原虫组氨酸富集蛋白(HRP)家族中，HRPⅡ和HRPⅢ有明显的促进疟色素形成功能。因此，如能特异阻断这些基因表达，抑制疟色素的形成，有可能使之成为一种抗疟新途径。HRPⅡ与HRPⅢ从同一祖先基因分化而来，二者高度同源，翻译起始位点附核苷酸序列则完全相同。

　　3.2　锥虫

　　属于动基体目的布氏锥虫(Trypanosoma burcei)通过抗原不断变异逃避宿主的免疫力，抗原变异是由于不同的变异体专一表面糖蛋白(variant-specific surface glycoprotein，VSG)基因呈间断表达所致，VSG基因表达产物在锥虫表面形成外膜，覆盖虫体。研究表明，VSG mRNA可分为二部分：一部分是各种变异体特有的主外显子序列，占主要部分；另一部分是共同的5'端小外显子序列，通常为35个核苷酸长，几乎所有的VSG mRNA均含有此序列。实际上，除VSG外，锥虫的钙调蛋白、微管蛋白和磷酸丙糖异构酶mRNA中也存在共同的5'端小外显子序列，这似乎是动基体目寄生原虫编码基因的共同结构特征。由于宿主mRNA无这种小外显子序列，以小外显子序列为靶的AON就很容易实现抑制众多基因表达的效果，使反义核酸抗锥虫感染成为可能。

　　Cornelissen等应用麦胚提取物转译系统、35S-甲硫氨酸掺入试验和蛋白质SDS-PAGE方法，对与锥虫小外显子序列不同位点互补和不同长度的AON体外转译抑制作用进行了比较分析。结果所有AON均能抑制转录，且抑制程度与AON长度和浓度有关，AON越长，浓度越高则抑制作用越强。如3个12nt和AON抑制率达35％－60％，而22nt和34nt aON在浓度为15－30μmol/L时对锥虫总RNA转录抑制率高达95％－100％。在同一转译系统中，BMV病毒(Brome mosaic Virus)和无小外显子序列的锥虫磷酸甘油酸激酶mRNA却完全不受34 nt AON的抑制，与锥虫小外显子序列不互补的18 nt AON对锥虫转译则无任何影响。上述发现充分证明，以锥虫5'端小外显子mRNA序列为靶的AON对转译具有特异抑制作用。

　　Walder等用兔网织红细胞转译系统，也获得上述相类似的结果。Verspieren等研究表明，小外显子AON的二级结构和碱基的修饰会直接影响其与靶mRNA的亲和性，从而间接影响AON的转译抑制效果。如上述与小外显子第2位至第13位碱基互补的12nt aON，虽然抑制布氏锥虫转译，但不能抑制活动锥虫(Trypanosoma vivax)mRNA转译，这显然与二种虫体的小外显子第3位和第7位碱基不同有关。

　　Verspieren等首次尝试用吖啶衍生物(acridine derivative)修饰布氏锥虫5'端小外显子序列的AON，观察其对培养虫体的杀伤作用。结果表明，连接有吖啶分子的9nt aON与相同长度但未连接吖啶分子的AON相比，能更为有效地抑制锥虫蛋白质的体外合成，且能有效地杀死体外培养虫体。无论如何，未连接吖啶的9nt aON和虽连接吖啶但不与锥虫5'端小外显子序列互补的9nt AON，均不能杀死培养虫体。AON经吖啶修饰后能提高其杀锥虫作用，推测可能与下述因素有关：一是通过吖啶修饰增加AON与靶mRNA间的亲和力，二是提高对3'端核酸外切酶的抗性，延长其作用半衰期，三是促进AON对活细胞膜的穿透。因此，对AON进行吖啶修饰提高其作用效率值得研究借鉴。