益气活血方药对老年大鼠肝脏衰老相关基因表达(2)

　　1材料与方法

　　1.1实验中药 益气方选用党参、黄芪、炙甘草（取自《时氏医道》保元汤），活血方选用川芎、当归、赤芍（取自经方四物汤）。中药制剂采用水提醇沉法制备后，分装于消毒好的塑料瓶中，于－20 ℃保存。

　　1.2实验动物 SD雄性大鼠（上海中医药大学实验动物中心提供）24只，分成青年对照组（5月龄）、老年对照组（22月龄）、老年益气组（22月龄）和老年活血组（22月龄）。老年益气组和活血组的用药剂量为临床成人剂量的20倍（按每千克体质量的用药量进行换算），采用饮料方式给药，每周服药5 d，停药2 d，自18～22月龄连续给药4个月。

　　1.3RTPCR 肝组织细胞总的RNA按Trizol一步法提取，具体步骤按试剂说明书操作。βactin PCR引物［6］：5’CCAGCCATGTACGTTGCTATCCAG 3’，5’GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA 3’，扩增片段为378 bp；p16 PCR引物：5’ATGGAGTCCTCTGCAGATAG 3’，5’TTAG CGCTGCTTTGGGGGTT 3’，扩增片段为480 bp；p21PCR引物：5’ATGTCCGATCCTGGTGATGT3’，5’GGGCTTTCTCTTGCAGAAGA 3’，扩增片段为495 bp；cyclin D1 PCR引物：5’ATGGAACACCAGCTCCTGTG 3’，5’TGGTGTTCCATGTCGGTGG 3’，扩增片段为888 bp；PCNA PCR引物：5’ATGTTTGAGGCACGCCTGAT3’，5’AGATCCTTCTTCATCTTCGA 3’，扩增片段为786 bp；cyclin E PCR引物：5’AAAGAAGAAGGTGGTTCCGA 3’，5’TCATTCTGTCTCCT GCTCAC 3’，扩增片段为1 191 bp。PCR扩增反应总体积为50 μl。扩增程序为：95 ℃（30 s）→ ［变性94 ℃（30 s）→退火55 ℃(30 s)→延伸72 ℃ (30 s)］×30个循环→72 ℃ （7 min）→4 ℃贮存。根据目的片段的长短及引物的Tm值设置退火温度及延伸时间。PCR产物鉴定电泳，紫外灯下观察，图像分析系统扫描。

　　1.4Western Blotting 采用放射免疫沉淀测定法(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)［7］。取肝脏组织100 mg加入单去污细胞裂解液900 μl，冰浴中匀浆。匀浆后立即加入100 μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟液(phenylmethylsulphonyl fluoride, PMSF)和40 μl混合蛋白酶抑制complete液(complete EDTAfree protease inhibitor cocktail tablet, 1片加1 ml水），4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清液于－70 ℃冷冻保存。24 h后10 000 r/min离心10 min，取上清液分装，－70 ℃冷冻保存。Lowry (FolinCiocalteau)法［8］测定蛋白含量。各组蛋白各取30 μg，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)和免疫印迹反应，用Supersignal ECL发光剂荧光显色X光胶片曝光，观察蛋白条带。

　　1.5图像处理及统计分析 RTPCR、Westernblotting实验结果分别采用Leica Q500IW和上海复日Smartview 2001生物电泳图像分析系统进行图像分析。所有实验数据均采用SPSS 9.0统计软件进行统计处理，统计学方法采用方差分析及q检验。

　　2结果

　　2.1益气、活血方药对大鼠肝脏衰老相关基因mRNA表达的影响与青年组比较，老年大鼠肝脏p16、p21、cyclin D1基因mRNA的表达明显上调（P