乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响(2)
2014-10-11 01:31
导读：1.3 存活性鉴定 分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，
1.3 存活性鉴定 分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液，在5%CO2，37°C培养。
1.4 形态学观察 （1）脂肪染色：取不同培养时间的肝细胞，4%多聚醛溶液固定，油红O（Oil Red O）染色，再用苏木精衬染细胞核，缓冲甘油封片后，观察肝细胞中脂肪的含量。（2）苏木精-伊红（HE）染色：固定的肝细胞用苏木精-伊红染色，脱水透明后，观察不同生长时间的细胞形态变化。
1.5 脂肪酸氧化速度 肝细胞脂肪酸氧化速度根据文献进行［1］，将分离的肝细胞接种到12孔细胞培养板中，2 ×105/孔，细胞贴壁12h后开始测定肝细胞脂肪酸的氧化速度。先用PBS洗涤细胞2次，每孔加入500μl含有0.5mg/ml BSA，22μM ［9，10(n)-3H］棕榈酸 (1μCi/孔)的Hanks液，试验孔中同时加入20mM乙醇，每组3个复孔。37°C培养2h后将培养液立即转移到玻璃试管中，并采用0.5ml Hanks液洗涤细胞2次，将洗涤液也加入玻璃试管中。采用Folch法抽提脂肪酸，每管中加入8ml 甲醇/氯仿(2:1)和0.5ml 2 M KCl/2 M HCl溶液。剧烈混合30min后离心，将上层水相转移到一个新的玻璃试管中，继续采用甲醇/氯仿抽提一次，将水相转移到闪烁瓶中，加入10ml闪烁液，混合后采用闪烁计数器测定脂肪酸氧化后生成的3H2O量。肝细胞的蛋白含量采用Brad-ford法进行测定。
2 结果
2.1 分离肝细胞存活率 肝细胞分离的存活率，大于95%。
2.2 形态学观察结果 分离的肝细胞，在培养12h后即能够充分贴壁生长。肝细胞在生长的早期（24～48h）细胞状态较好，可见明显细胞极性，细胞排列生长（图1A）。细胞生长后期（
