小鼠胚胎干细胞定向分化为神经细胞的研究进展(2)

　　1.2 “五步法”方案［10］ (1)扩增未分化的胚胎干细胞；(2)去除分化抑制剂或促有丝分裂素，ES细胞开始分化，不贴壁悬浮生长，形成EB；(3)去除生长因子，选择巢蛋白（nestin）阳性细胞（即神经前体细胞）；(4)使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞；(5)利用促神经元存活因子诱导并维持神经元成熟。该方案不用RA处理EB，而是将EB在一种选择性的无血清培养基上培养。因为EB中的非神经细胞不能在这种培养条件下生存，所以大部分存活下来的细胞是nestin阳性的神经前体细胞［11］。这些神经前体细胞可被高效地诱导分化为神经元［12］。

　　该方案的主要优点是在进一步分化为神经元或神经胶质细胞之前，神经前体细胞已经得到较高的纯化，这有利于特定类型神经细胞的获得。但是，其操作较“4-/4 方案”复杂，而且多种生长激素、神经营养因子的应用增加了成本且不利于分化机制的阐明。
　　
　　通过EB途径由ES细胞分化而来的神经元多数为γ-氨基丁酸（GABA）能神经元，少数是谷氨酰胺能神经元。通过改变诱导分化的条件，可以得到不同类型的神经元或神经胶质细胞，并提高分化效率。腹侧中脑和后脑是多巴胺能神经元和5-羟色胺能神经元产生的部位，SHH(sonic hedgehog)和FGF-8（fibroblast growth factor-8）对这两部分的形态发生起重要作用［13］，Lee等人［10］用这两种分子处理EB来源的神经前体细胞得到了多巴胺能神经元和5-羟色胺（5-HT）能神经元。 2002年Wichterle等人［14］用背侧分子（RA）和腹侧分子（Hh-Ag1.3,一种SHH的拮抗剂）处理EB，得到了腹侧脊髓运动神经元。2005年Tsuchiya等人［15］在经典的“五步法”方案基础上，在第五步除去bFGF（basic fibroblast growth factor），用含有层粘连蛋白的N2培养液中成功诱导分化出微小胶质细胞，并进一步用含有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和粒单细胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI-1640培养液扩增细胞，得到89.0%的微小胶质细胞。

　　2 基质细胞诱导的神经细胞的分化 本文来自中国科教评价网

　　第二类诱导神经细胞分化的方法是基质细胞诱导方法，该方法的诱导机制尚不清楚，目前称为“基质细胞来源的诱导活性作用（stromal cell-derived inducing activity , SDIA）”［16］。

　　2000年Kawasaki等人描述了一种经基质细胞诱导ES细胞分化为多巴胺能神经元的方法［16］。这一方法中，神经细胞的分化通过ES细胞与小鼠骨髓来源的基质细胞PA-6细胞单层共培养而实现。实验结果表明，92%的细胞表现为神经细胞黏附分子（nerve cell adhesion molecule, NCAM）阳性，其中多数为酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）阳性细胞。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶，因此是多巴胺能神经元的一个很好的分子标志。2005年Yamozoe等人［17］用含有肝素的磷酸盐缓冲液冲洗培养的PA-6细胞得到含有所谓神经诱导因子（neural inducing factors, NIF）的溶液，用此溶液培养小鼠ES细胞，发现小鼠ES细胞可以在含有33%NIF溶液的培养液中生存，并且随着培养液中肝素浓度的增加，ES细胞分化为神经细胞的比例也增高。值得注意的是，PA-6细胞介导的神经细胞分化受到血清或BMP-4的抑制，血清和BMP-4的加入可引起ES细胞分化为多种非神经细胞。PA-6细胞的SDIA作用并不能使所有类型的干细胞诱导分化为多巴胺能神经元，例如，2005年Roybon等人［18］报道，对于神经前体细胞，PA-6细胞不能促进其向多巴胺能神经元分化，而是促进其向星形胶质细胞的分化。

　　2003年Barberi等人［19］描述的一种经基质细胞诱导分化的方法可以将ES细胞分别诱导分化为多种神经细胞。这一方法将小鼠骨髓来源的基质细胞MS5或S17或主动脉-性腺-中肾区来源的原始基质细胞作为饲养层细胞与ES细胞在血清替代培养液中共同培养，得到神经前体细胞，再用不同的细胞因子序贯处理这些神经前体细胞，分别可以得到较高百分比的胆碱能神经元、5-羟色胺能神经元、多巴胺能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。将得到的多巴胺能神经元注射到6-OHDA诱导的帕金森模型动物的患侧纹状体内，8周后由中枢神经系统兴奋剂amphetamine或者纹状体D1、D2受体激动剂apomorphine所诱导的旋转不稳定症状得到了显著改善，并且可以在注射细胞的纹状体内发现大量的酪氨酸羟化酶阳性细胞。