异氟醚减少离体鼠肝缺氧－复氧损伤与枯否细胞

       作者；李 泉，俞卫锋，曹云飞，杨立群，吕 欣，周脉涛 

【摘要】  目的  明确异氟醚减少离体鼠肝缺氧－复氧损伤的作用主要发生在哪一阶段，以及与枯否细胞的关系。方法  将大鼠肝脏取下，置于离体鼠肝灌流仪中，以经95% O2/5％ CO2饱和的改良克－林氏碳酸氢盐缓冲液恒压灌流（有氧状态用1.2kPa，缺氧状态用0.2kPa），维持生理pH值和温度，实时监测灌流液中LDH变化。2MAC异氟醚分别用于缺氧期、复氧期和缺氧－复氧期。用GdCl3选择性抑制枯否细胞活性。结果  (1)2MAC异氟醚用于缺氧－复氧期和单纯用于复氧期均可抑制LDH升高，而单纯用于缺氧期则无明显作用。(2)2MAC异氟醚和(或)GdCl3组均可抑制肝脏缺氧－复氧后LDH升高。结论  异氟醚保护缺氧－复氧肝脏免受损伤的作用主要发挥在复氧期，异氟醚在复氧期发挥保护作用可能与抑制复氧引起的氧自由基爆发有关，其作用与枯否细胞活性密切相关。
   
    【关键词】  异氟醚；离体鼠肝；缺氧－复氧损伤；枯否细胞
        
    【Abstract】  Objective  To investigate which stage is the most important and the relationship with kupffer cell，during isoflurane decrease anoxia-reoxygenation injury in isolated rat liver.Methods  We established the model of isolated rat liver.It included artificial lung，pump，pressure meter，flow meter，thermostat，humidifier and monitors.Rat livers were harvested and placed in the model.They were flushed with modified Krebs’buffer，which were saturated with 95% O2 / 5% CO2 and were added with 10 mM glucose and 1% albumin.The perfusion pressures were controlled constantly at 1.2 kPa(oxygenation) or 0.2 kPa(anoxia).PH and temperature were maintained properly，and oxygen pressure or liver flow were measured.2MAC isoflurane were used in the periods of anoxia，reoxygenation or anoxia-reoxygenation separately.GdCl3 was used to inhibit the activation of kupffer cell.Results  (1)2MAC isoflurane inhibited LDH release in the periods of both anoxia-reoxygenation and reoxygenation in isolated rat liver，while it was not effective in the period of anoxia.(2)Both 2MAC isoflurane and GdCl3 decreased LDH release obviously after anoxia and reoxygenation in isolated rat liver.Conclusion  Reoxygenation stage is the most important during isoflurane decrease anoxia-reoxygenation injury in isolated rat liver.Isoflurane may protect hepatic function by inhibiting oxygen stress outside cells，which is related to kupffer cell. 大学排名
   
    【Key words】  isoflurane；isolated rat liver；anoxia-reoxygenation injury；kupffer cell
   
    研究表明肝脏缺血－再灌注损伤分为两相［1］：第一相（再灌注后6h内）是以枯否细胞介导为主的早期再灌注损害。第二相（再灌注后6h后）是以中性粒细胞介导为主的后期再灌注损伤。本研究以离体无血灌流鼠肝为模型，研究异氟醚如何保护肝脏缺氧－复氧损伤，以及与枯否细胞的关系，排除中性粒细胞可能带来的影响。
   
    1  和方法
   
    1.1  材料  实验动物选用雄性健康Wister大白鼠，重约200～250g（军事科学院），所有动物实验前禁食24h。三氯化锝（GdCl3）处理组在实验前24h经尾静脉注射GdCl3 7.5mg/kg，对照组注射等量的生理盐水。
   
    1.2  建立离体鼠肝灌流模型  用戊巴比妥钠腹腔麻醉后开腹，小心分离肝周韧带和血管，经下腔静脉注入肝素50u，然后迅速完成肝下下腔静脉插管，门静脉插管，并结扎肝上下腔静脉，开始非循环灌流，可见肝脏即刻呈均匀土黄色，取下鼠肝置于离体鼠肝灌流仪中，开始循环灌流。离体鼠肝灌流仪经米氏灌流仪包括人工肺、动力泵、测压表、流量计、恒温保湿系统和监测系统组成。灌流液选用改良的克－林氏缓冲液，包括：NaCl 117mM，KCl 4.7mM，CaCl2 1.5mM，KH2PO4 1.19mM，MgSO4 1.14mM，NaHCO3 24.8mM，另外加入葡萄糖10mM维持营养，加入1％牛血清白蛋白维持胶体渗透压，有氧灌流用1.2kPa，缺氧灌流用0.2kPa，根据pH监测调节pH在7.35±0.05范围内。实时监测灌流液中LDH水平。
   
    1.3  实验处理步骤  待循环灌流20min模型稳定后开始从零计时，2MAC异氟醚分期给如下：缺氧期：缺氧前20min至再灌注前10 min（即-20min～50min）；复氧期：再灌注前10min至实验结束（即50～120min）；缺氧－复氧期：缺氧前20min至实验结束（即-20～120min）。 （科教作文网 zw.nseac.com整理）
   
    1.4  学方法  所有数据以均数±标准差(x±s)表示，应用t或方差分析，以P≤0.05为统计学差异有显著性。
   
    2  结果
   
    2.1  比较2MAC异氟醚用于缺氧－复氧各期对肝损伤的不同影响  异氟醚用于缺氧－复氧期和单独用于复氧期均可明显抑制LDH水平（P<0.01），同样发挥保护肝细胞的作用，说明异氟醚保护肝脏免受缺氧－复氧损伤的关键是作用在复氧期(见图1)。
   
    2.2  比较2MAC异氟醚与GdCl3对肝脏缺氧－复氧损伤的影响  异氟醚组、GdCl3组及异氟醚＋GdCl3组均明显抑制LDH水平（P<0.01），说明GdCl3可通过抑制KC活性保护肝脏缺氧－复氧损伤，而2MAC异氟醚可能也有类似作用(见图2)。

复氧0～45min内LDH的释放量(IU/min)

处理组与缺氧—复氧对照组相比，*P＜0.05，n=7

图1  2MAC异氟醚用于肝细胞缺氧-复氧

各期对肝损伤的不同影响
复氧0～15min内LDH的释放量(IU/min)
处理组与缺氧—复氧对照组相比，*P＜0.05，n=7 

图2  2MAC异氟醚和GdCl3对肝细胞缺氧-复氧损伤的影响

    3  讨论
   
    根据研究结果，我们认为：异氟醚保护肝脏免受缺氧－复氧损伤的关键是对复氧期发挥了作用，这种作用可能与抑制KC活性有关。
   
    如图1所示：2MAC异氟醚单独用于复氧期所产生的效果和用于缺氧－复氧全期所产生的效果一样明显，而异氟醚单独用于缺氧期则无明显效果，这充分说明了异氟醚的保护作用是发挥在复氧期，而与缺氧期关系不大。有人认为异氟醚降低肝细胞氧耗的原因是抑制了某些耗能反应，从而异氟醚可能通过此机制来增强肝细胞乏氧耐受力。如果此观点成立，那么异氟醚就应该在缺氧期保护了肝细胞活性，降低了LDH水平，显然这一点与本实验结果不一致。因为本实验使用了禁食24h的大鼠肝脏，所以无法观察异氟醚对缺氧期糖酵解的影响。 （转载自科教范文网http://fw.nseac.com）
   
    异氟醚在复氧期发挥保护作用可能与抑制复氧引起的氧自由基爆发有关，有人发现麻醉药可抑制中性粒细胞中产生氧自由基及其损伤［2，3］，又有人证明氟烷可抑制单核细胞产生H2O2［4］，所以我们推测异氟醚有降低复氧期氧应激的作用。
   
    如图2所示，GdCl3抑制了KC细胞活性后，肝脏缺氧－复氧损伤程度明显下降，可见肝脏缺氧－复氧早期损伤中KC的重要作用。而2MAC异氟醚发挥了类似作用，所以我们认为异氟醚的保护作用可能与抑制KC活性有关。近来的研究发现：蛋白激酶C（PKC）的活性能被吸入麻醉药抑制［5］，而PKC－NADPH氧化酶途径是KC产生细胞外O2-的关键途径［6，7］，所以异氟醚可能通过抑制KC中PKC介导的信号途径来减少O2-产生，抑制肝脏复氧损伤，更直接的证据有待在进一步研究中得到。

【参考文献】

    1  Jaeschke H，Anwar F.Neutrophil and kupffer cell-induced oxidant stress and ischemia-reperfusion injury in rat liver.Am J Phsiol，1991，260：G355-362.    
    2  曹云飞，俞卫锋.异丙酚对中性粒细胞活性氧生成及细胞内游离Ca2+浓度的影响.临床麻醉学杂志，2000，16(2)：96-98.    
    3  曹云飞，薛惠斌，俞卫锋.异丙酚对红细