人用H5N1禽流感疫苗毒种检定及毒种库建立(2)

　　图6   R1203株与原始毒株不同氨基酸序列（略）

　　247   序列同源性   R1194（P5）与R1203（P5）的核苷酸序列同源性为991 %; R1194（P5）与R1194（P10）的氨基酸序列完全相同; R1203（P5）与R1203（P10）仅2个氨基酸不同。

　　25   无菌试验和外源因子检查   符合现行版《中国典》的要求。

　　26   毒种免疫源性测定   R1194（P5），R1203（P5）2毒株，各制成15μgHA/05ml, 免疫家兔4只，2针（隔14d），首针后28d，测得血清中的中和抗体滴度均 ≥ 1∶40。

　　27   显微镜观察   R1194（P5），R1203（P5）2毒株的尿囊培养液，经浓缩、纯化的电镜照片均可看见完整的病毒颗粒。

　　28   毒种库的建立   根据现行版《中国药典》三部通则中 “生物制品生产和检定用菌毒种规程”〔4〕的要求,将R1194和R1203毒种建立了三级种子库;即原代、主代和工作代。(1)原代:引进的毒种P2作为原代。(2)主代:原代在胚蛋中传2代P4作为主代。(3)工作代: 主代在胚蛋中传1代P5作为工作代。

　　3   讨论

　　据报道，禽用禽流感疫苗的研究已取得突破性进展〔8〕,基本解决禽类的问题,已规模生产。但人用禽流感疫苗的研究仍在进行中。据国际制药企业协会联合会( IFPMA )2006年5月的〔9〕，全球H5N1禽流感疫苗人体观察的地区有法、美、英、德、日、澳、俄、比利时、(中国未列入)等，并取得较大的进展〔10-13〕。所用的毒种有NIBRG-14， NIBRG-4，VI1203，US-NIAID, A/HK/492/1997等,其中也包括本研究的2株。一旦H5N1禽流感病毒获得由人传人的能力，此疫苗的需求量必然极大，目前国际上任何一家流感疫苗生产厂都不可能满足供应，因而凡生产普通流感疫苗的厂家，必须做好生产禽流感疫苗的技术贮备，以供急需〔14〕。本文引进的2株H5N1亚型禽流感病毒，经序列测定表明，均已去除毒性基因，即血凝素基因中表达R-R-R-K-K-R的氨基酸序列，事实上，仅去除有毒基因的H5N1毒株尚不能用于疫苗生产，还必须适应在胚蛋中增殖的能力，才能用于制造疫苗，故还需将去除毒性基因的毒株通过反向遗传技术，将减毒株的HA和NA基因及胚蛋适应株A/PR/8的其他6个基因和它的4个复制酶基因分别克隆到质粒上，共同转染Vero细胞，获得遗传重配的病毒株。研究表明，经过减毒的重配株R1194和R1103均能在胚蛋中大量增殖。经对2种减毒株检定时发现,在血凝仰制试验中,普通流感病毒A1,A3,B型与H5N1禽流感病毒之间均有一定的交叉反应,，滴度大都在≥1∶40，这不能表示普通流感病毒和H5N1病毒的抗体，具有相互保护的能力，从单扩试验表明，它们之间没有交叉；经中和试验也证明它们之间没有相互中和的能力。因而判断禽流感疫苗的质量，不能仅靠血凝抑制试验的结果来决定疫苗接种后的免疫效果，更重要的是观察中和抗体的产生和它的效价。

　　　　参考文献

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　　〔5〕   美国国家生物信息中心基因库(NCBI GenBank)［EB］.登录号:AY651333.

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　　〔14〕   郭元吉.禽流感的十大热点问题［J］.科学,2006:(1):24-29.