广东土牛膝及咽炎方合剂中12,13-二羟基泽兰素对

　　【摘要】  目的从广东土牛膝中制备咽炎方合剂中的特征成分12,13-二羟基泽兰素对照品。方法结合液液萃取、硅胶柱色谱、制备型高效液相色谱(HPLC)对广东土牛膝醇提物进行分离纯化，通过紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)等进行结构鉴定，分析型HPLC和薄层色谱(TLC)进行含量测定。结果制得的对照品为12,13-二羟基泽兰素，含量大于98.0%。结论该化合物可作为广东土牛膝及咽炎方合剂的质量控制以及药效物质基础研究用的化学对照品。

　　【关键词】  广东土牛膝; 咽炎方合剂; 12,13-二羟基泽兰素; 对照品

　　Abstract：Objective To prepare 12,13-dihydroxyeuparin reference substance from Radix Eupatorii Chinensis, the characteristic composition in Yanyanfang Mixture. MethodsThe extract of Radix Eupatorii Chinensis was isolated and purified by liquid-liquid extraction, silica gel column chromatography and preparative high performance liquid chromatography(HPLC). The structure of 12,13-dihydroxyeuparin was identified by ultraviolet spectra (UV), infrared spectra(IR), mass spectra(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR). The content was determined by analytical HPLC and thin-layer chromatography (TLC).ResultsThe content of the product was higher than 98%.ConclusionThe compound can be used as a reference substance for quality control and the research of pharmacodynamic action.

　　Key words：Radix Eupatorii Chinensis; Yanyanfang Mixture; 12,13-dihydroxyeuparin; Reference substance

　　广东土牛膝Radix Eupatorii Chinensis为菊科植物华泽兰Eupatorium chinense L.的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽、抗炎镇痛的功效[1,2]，有喉科圣药之称。以广东土牛膝为主药的复方制剂在广东地区的医院里被广泛使用，但国内有关广东土牛膝在复方制剂中的特征成分未见报道。本实验对广东土牛膝药材及其复方制剂咽炎方合剂(中山大学附属第一医院研制)进行化学成分研究，首次从该植物中分离得到12,13-二羟基泽兰素(12,13-dihydroxyeuparin)，符合中药化学对照品的相关要求[3,4]，可用于该药材和咽炎方合剂的质量控制和药效物质基础研究。

　　1 仪器与材料

　　BIO-RAD制备型液相色谱仪，Waters1525分析型高效液相色谱仪(2996PAD检测器，Empower色谱工作站)，Bruker AvanceⅢ 400MHz核磁共振波谱仪，岛津LCMS-IT-TOF质谱仪，Bruker Tensor 37傅立叶变换红外光谱仪，SRS Optimelt熔点测定仪，WFH-203B三用紫外分析仪，亚荣RE-300旋转蒸发器。

　　广东土牛膝购于广州市药材公司，由中山大学药学院徐新军博士鉴定，咽炎方合剂由中山大学附属第一医院提供。薄层硅胶和柱层析硅胶(青岛海洋化工厂);甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　2.1.1 分析型HPLC：迪马Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);检测波长205～400 nm;柱温为室温，流速1 ml·min-1，进样量20 μl。流动相为0.2%磷酸水溶液-乙腈梯度1洗脱(咽炎方制剂分析)：0～10 min，乙腈10%;10～40 min，乙腈10%～40%;40～60 min，乙腈40%～60%。0.2%磷酸水溶液-乙腈梯度2洗脱(药材萃取物分析)：0～10 min，乙腈10%;10～40 min，乙腈10%～40%;40～50 min，乙腈40%;50～65 min，40%～80%乙腈;65～80 min，乙腈80%。0.2%磷酸水溶液-乙腈(80∶20，对照品纯度分析)。

　　2.1.2 制备型HPLCKromasil C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)，流动相为水-甲醇(65∶35);检测波长254 nm，流速5 ml·min-1，进样量0.5 ml。

　　2.2 广东土牛膝在咽炎方合剂中的特征成分确定咽炎方合剂系由广东土牛膝、岗梅、甘草等中药水煎煮浓缩而成，广东土牛膝是方中君药。用HPLC对咽炎方合剂、广东土牛膝水煮液和乙醇提液、咽炎方缺广东土牛膝阴性溶液进行分析，选择广东土牛膝在制剂中峰面积最大的成分作为分离纯化目标。如图1所示，峰1为咽炎方合剂与广东土牛膝水煮液相对应的色谱峰，确定其为目标化合物。由于峰1在广东土牛膝乙醇提取液中含量较高，选择用95%乙醇提取广东土牛膝药材，制取浸膏供分离对照品用。

　　2.3 对照品的分离与制备取广东土牛膝药材3 kg，粉碎，95%乙醇回流提取2次，1.5 h/次。合并提取液，减压浓缩，得乙醇提取物50 g。取乙醇提取物与水混悬，依次以石油醚、乙醚、正丁醇萃取，得石油醚萃取物23 g，