龙血竭中龙血素A在大鼠体内的药动学研究(2)

　　大鼠禁食(自由饮水)12 h后，按100 g大鼠给予龙血竭250 mg，灌胃给药。分别在第0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10 h于颈动脉取血,置于用肝素预处理过的离心管中。取全血1 mL置离心管中，加入乙腈2 mL、乙酸乙酯1 mL，涡旋混合均匀，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，提取3次，合并上清液，50 ℃水浴挥干，于残渣中加入100 μL甲醇，超声处理使之溶解，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液作为样品，注入高效液相色谱仪进行测定，记录色谱图与峰面积，采用外标法定量。

　　2.3方法学考察[3]

　　2.3.1龙血素A对照品贮备液的制备取龙血素A对照品，用甲醇配制成每1 mL约含100 μg的溶液，作为对照品贮备液。

　　2.3.2方法专属性取大鼠2只，实验前禁食12 h，自由饮水，1只做空白对照，1只按100 g给予龙血竭250 mg灌胃给药，给药2 h后取血样，按“2.2”项下方法操作测定。由图1可见，全血中的内源性物质不干扰龙血素A的测定，表明本方法有较好的专属性。[PSD261;S*2〗A.空白血浆; B.空白血浆+对照品; C.样品图1 HPLC图谱Figure 1HPLC chromatograms

　　2.3.3标准曲线与最低检测限取空白全血适量，精密加入龙血素A对照品储备液，配制质量浓度为0.076、0.151、0.302、0.605、1.209、2.418、4.836 μg·mL-1的系列浓度标准溶液，按“2.2”项下的方法，自“加乙腈2 mL、乙酸乙酯1 mL”起，依法操作，记录峰面积。以质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行回归，结果表明龙血素A的质量浓度在0.076～4.836 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好，回归方程为：A=49679ρ+2784.3，r=0.998 3(n=7)。取标准曲线用溶液，逐步稀释至溶液中龙血素A的响应值约为基线噪音的3倍(S/N=3)，记录色谱图，得出最低检测限(LOD)为0.025 μg·mL-1。

　　2.3.4相对回收率与精密度精密量取对照品储备液，以空白全血分别配成高、中、低3种质量浓度(4.836、1.209、0.076 μg·mL-1)的样品溶液，按 “2.2” 项下的方法，自 “加乙腈2 mL、 乙酸乙酯 1 mL”起，依法操作。记录峰面积并代入标准曲线计算各样品浓度，计算相对回收率。结果表明，高、中、低3个质量浓度的样品的相对回收率均高于80%。见表1。

　　取以上高、中、低3个质量浓度的样品溶液于同一天内连续测定3次，计算日内RSD;每天测定3种浓度样品各1次，连续测定3 d，计算日间精密度RSD。结果日内和日间精密度RSD值均小于10%，表明该法精密度较好。见表1。

　　2.3.5样品稳定性精密量取对照品储备液，以空白全血配制质量浓度为0.076、0.605、1.209、2.418 μg·mL-1的样品，分别考察室温25 ℃放置0、4、12、24 h，-20 ℃冰箱放置24 h，-20 ℃下反复冻融3次的稳定性。结果各样品的RSD值均在2.76%～11.42%(n=6)之间，符合《中国药典》相关规定，表明样品稳定性较好。表1龙血素的回收率与精密度

　　2.4大鼠体内的药动学

　　取SD大鼠66只，禁食不禁水12 h后，按时间点随机分为11组，每个时间点6只，按100 g体质量给予龙血竭250 mg灌胃给药，采集不同时间点的血样，按“2.2”项下方法处理样品并测定龙血素A的浓度。

　　2.4.1血药浓度曲线按不同时间点求算平均血药质量浓度，