新型黑麦酮酸D衍生物D69抗乳腺癌活性研究(2)

　　1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和ZR-75-30培养于含5%(φ)胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L HEPES、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5%(φ)CO2孵箱中孵育培养;传代时先用1× PBS清洗细胞，再用含0.02%EDTA的0.05 %胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。人乳腺上皮细胞HMEC培养于无血清KSFM培养基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培养;传代时用上述胰酶消化，以胰酶抑制剂终止消化。以上细胞培养相关试剂均为Invitrogen/Gibco公司产品，胎牛血清购自Hyclone公司。

　　1.2.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖将MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞消化后重悬并计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培养。24 h后去除培养基，更换为含浓度依次为0、0001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 μmol/L D69的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48 h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入5 mg/mL MTT (Genview公司，用1×磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5 mg/mL，过滤除菌，分装后-20 ℃避光保存)溶液20 μL，37 ℃作用4 h，离心后弃上清液，加入DMSO 150 μL,振荡器振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为570 nm下的吸光度A值。细胞生长抑制率(%)=(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100 %。对照组即D69浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度(IC50)计算软件Bliss’s software计算IC50，应用SPSS软件进行数据统计分析。

　　1.2.3D69抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-435生长的体内实验每只BALB/c裸鼠右侧乳腺接种数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞5×106(100 μL)。接种肿瘤后第6天，将14只裸鼠随机等分为2组。待瘤直径在30~50 mm后，以30 μg/kg剂量的D69，每2天腹腔注射给药1次，持续30 d，观察并记录D69的体内抑瘤作用。肿瘤体积计算公式：体积(mm3)=长径×短径2×π/6。根据各组皮下移植瘤体积，计算各个时间点肿瘤体积的均数值并绘制肿瘤生长曲线。D69注射29 d后，处死，迅速取下肿瘤标本，称重。抑制率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。所有动物实验操作均遵守《实验动物管理条例》(中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号，1988)。

　　1.2.4统计学分析数据结果以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有显著性。

　　2结果

　　2.1D69对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、ZR-75-30生长和形态的影响

　　在倒置光学显微镜下观察D69处理后细胞生长情况及形态学变化，发现D69对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、ZR-75-30的生长具有显著的抑制作用(见图1、2)。随着D69浓度的增加，细胞生长抑制及细胞死亡现象越来越明显，出现大面积的脱落，细胞及细胞碎片漂浮液面。这种细胞形态的改变与细胞凋亡所发生的形态改变十分的相似[11]。[PSa6681;S*2〗　　图1人乳腺癌细胞MDA-MB-435经不同浓度D69处理后的形态变化(200×,48 h)Figure 1Morphological changes of human breast cancer cells MDA-MB-435 treated with indicated concentrations of D69(200×,48 h)

　　2.2D69对人永生化乳腺上皮细胞HMEC生长和形态的影响