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论Nogo受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

2013-10-29 01:33

摘要： 目的 探讨Nogo受体拮抗剂NEP1-40对大鼠脊髓损伤后脊髓功能恢复的影响，为临床治疗急性脊髓损伤提供实验依据。方法 健康Wistar大鼠48只随机分为创伤对照组、NEP1-40治疗组。建立大鼠中段胸部脊髓后半部横切模型。对照组注入生理盐水，实验组采用NEP1-40治疗。分别在术后取材行苏木精-伊红染色、免疫荧光染色检测。术后第1、3天及1、2、3、4周对动物进行运动功能评分。结果 脊髓损伤3周后，NEP1-40组行为学评分高于对照组，同时NeuN/NF-200阳性染色亦明显高于对照组，差异有统计学意义。结论 NEP1-40治疗脊髓损伤能促进神经元的再生，恢复脊髓功能。

关键词： 大鼠；脊髓损伤；Nogo受体拮抗剂；再生

脊髓少突胶质细胞所分泌的Nogo蛋白是目前已知最强的神经轴突生长抑制因子，对受损神经元再生具有极强的抑制作用［1］。Nogo受体拮抗剂(Nogo extracellular peptide, residues 1-40，NEP1-40)为针对Nogo-66氨基序列设计的Nogo受体(Nogo receptor，NgR)竞争性拮抗剂，能拮抗中枢神经抑制因子与NgR的结合，起到促进神经再生的作用［1-2］。本实验主要观察NEP1-40对于急性脊髓损伤大鼠运动功能的影响及对NF-200表达的影响，并进一步探讨NEP1-40治疗急性脊髓损伤的疗效和可能机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 主要试剂
　　NEP1-40、兔抗大鼠NeuN 抗体、小鼠抗大鼠NF-200抗体、抗兔IgG-FITC、抗小鼠IgG-RBITC，均购自北京博奥森生物技术有限公司。
　　1.2 动物及分组
　　健康成年Wistar大鼠48只(由苏州大学实验动物中心提供)， 雌性，体重250～300 g，随机分为生理盐水对照组、NEP1-40实验组。
　　1.3 动物模型的制作
　　参照Brosamle等［3］方法制作脊髓半横断模型。大鼠经腹腔麻醉后固定于立体定位仪上，常规消毒，以第8胸椎(T8)棘突为中心，手术显露棘突。手术显微镜下打开T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半横断，损伤深度1.0 mm（横断后侧和后外侧皮质脊髓束）。向尾侧硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10导管，BD公司），盐水冲洗切口，固定硬脊膜管，依次缝合，模型制作完成。

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　　生理盐水对照组通过置管每天注入生理盐水20 μl，NEP1-40组每天用微量进样器注入NEP1-40 10 μl(0.4 μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完毕后用10 μl生理盐水冲管，以保证药物进入蛛网膜下腔，连续使用4周。术后人工挤压膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。术后3天给予青霉素4万U／只。硬脊膜管外口予无菌保护，定期换药。
　　1.4 标本的收集和处理
　　所有动物均分别于脊髓损伤1、2、3、4周时用4%多聚甲醛经左心室-主动脉灌注后取出脊髓组织，灌注液中固定12 h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待组织沉底，冰冻切片机切片，厚度30 μm。
　　1.5 检测指标
　　1.5.1 组织学检查
　　苏木精-伊红染色，观察脊髓的组织学改变。
　　1.5.2 免疫荧光组织化学双重标记染色
　　选取脊髓切片经兔抗大鼠NeuN 抗体(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗体(1∶400)4℃孵育过夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC (1∶100)37℃孵育1 h，封片后用Leica激光共聚焦扫描显微镜观察免疫荧光双标结果。
　　1.6 运动功能评定
　　采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］运动评分法。在80 cm×130 cm×30 cm覆盖有防滑纸板的箱子中，每只实验鼠由2名非实验人独自观察4 min，对后肢的运动功能进行评分。0～21分的分级是根据关节的运动、体重的支撑、前后肢的协调和尾的位置等情况而定。0分代表大鼠后肢无运动，21分表示大鼠后肢运动功能正常。BBB评分分别于术后第1、3、7、14、21、28天进行。
　1.7 图像分析
　　免疫组化染色结果采用德国KONTRONIBAS 2.5全自动图像分析系统，在损伤的头尾两侧，分别取10个视野，计算免疫荧光阳性神经细胞数。