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消痰散结方对人胃癌MKN45裸鼠移植瘤生长及细胞增

2013-11-29 01:45 【关键词】 胃肿瘤; 中药; 增殖细胞核抗原; 表皮生长因子受体; 裸小鼠
　　中医学认为恶性肿瘤的发生、发展、转移与痰邪为病有密切关系。魏品康教授根据多年临床经验研制出消痰散结复方治疗胃癌，取得较好疗效［1，2］。本研究建立裸鼠胃腺癌模型，观察该药对裸鼠胃腺癌体内生长的抑制作用及其对胃癌组织中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）表达的影响，探讨消痰散结复方抑制胃癌细胞增殖的作用机制，现报告如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 实验药物及主要试剂 消痰散结方由半夏、天南星、茯苓、白芥子、陈皮、全蝎、鸡内金、炙甘草等组成，均购自上海市药材公司，产地明确，经第二军医大学药学院生药学教研室鉴定。常规方法煎煮，浓缩至含生药0.46 kg/L备用。5卜尿嘧啶（fluorouracil, 5睩U）10 ml，0.25 g，由上海旭东海普药业有限公司出品（批号060404），购自长征医院药房。主要试剂鼠抗人PCNA单抗（稀释度1∶100，代号M0879）和EGFR单抗（稀释度1∶20，代号M0886）购自美国DAKO公司。抗生物素蛋白链菌素补氧化物酶（streptavidin peroxidase, SP）连接法试剂盒和显色试剂盒，购自福建迈新公司。
　　1.1.2 实验动物 BABL/c裸鼠，雄性，共45只，体质量（20～22）g，8～10周龄，由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供。医学实验动物合格证书，编号0742；裸鼠动物合格证书，医动字第02492号。 （科教论文网 lw.NsEac.com编辑整理）
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 裸鼠MKN45胃腺癌模型建立 裸鼠MKN45人胃腺癌细胞株由中国科学院肿瘤生物技术研究所提供。制备接种细胞悬液，无菌操作。体外培养MKN45细胞生长密集时，用0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）消化1～2 min，倾出消化液，加入无血清1640液洗涤，离心，用无血清1640液配成接种细胞，浓度为2×106/ L。用相差显微镜观察呈均匀的单细胞悬液。皮下接种：无菌操作，消毒皮肤，取l ml注射器，抽吸出0.4 ml细胞悬液，接种在裸鼠右前肢根部皮下。裸小鼠皮下移植传代，取传代后14 d左右的裸小鼠，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状瘤组织，切成1 mm×1 mm×1 mm小块，置于生理盐水中备用。裸鼠称质量后以75 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，沿上腹正中线切开约1 cm，将备好的肿瘤组织块植入。术后逐日观察肿瘤生长情况，以小鼠腹部出现可触及的包块作为成瘤标志，观察小鼠一般活动及营养状态等变化。
　　1.2.2 实验动物分组及用药 将接种后的BABL/c裸鼠随机分为3组，消痰散结方组、化疗组及荷瘤对照组，每组各15只，无特定病原菌（specific pathogen free, SPF）条件下分笼饲养于层流架内。消痰散结方组，于接种后次日开始每只裸鼠灌服消痰散结方浓缩煎剂0.4 ml/次（相当于生药9.2 g/kg体质量）1次/d，连续灌胃6周。空白荷瘤对照组，亦于接种后次日开始每只裸鼠灌服生理盐水0.4 ml/次，1次/d，连续灌胃6周。化疗组，5睩U以生理盐水稀释成7.5 mg/ml，参照文献及本组以往研究经验按60 mg/kg腹腔注射，1次/周，连续用药3周。
　　1.2.3 移植瘤生长、小鼠活动及营养状况观察 接种后观察小鼠活动、进食及营养情况。6周后拉颈处死裸鼠,从腋部皮下完整剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，于电子天平上称取瘤质量。运用公式抑瘤率（%）＝（对照组治疗后平均瘤质量－用药组治疗后平均瘤质量）/对照组治疗后平均瘤质量×100计算抑瘤率。完成观察及称取质量的瘤组织用中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm连续切片。 （科教论文网 Lw.nsEAc.com编辑整理）
　　1.2.4 移植瘤组织PCNA、EGFR的测定 SP法，苏木素惨梁烊旧，石蜡切片脱蜡至水，微波修复抗原。每张切片滴加一抗（鼠抗人PCNA、EGFR）1滴，4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次后滴加生物素化二抗，每张切片上加1滴抗生物素蛋白链菌素补氧化物酶溶液，3，3'捕氨基及联苯胺底物显色10 min，二甲苯透明，中性树胶封闭。PCNA染色阳性物质呈棕黄色，颗粒状，位于胃癌细胞核内，在×200油镜下，随机计数200个以上的细胞作为分析基数，计数标记PCNA指数，即被标记细胞在一细胞群中所占的百分率。EGFR阳性染色大多位于胞浆及胞膜上，个别位于胞核上，为棕黄色颗粒，按染色深度和阳性细胞所占比例分别计分。（1）染色深度：0分，无着色；1分，浅着色；2分，深着色。（2）阳性细胞比例：0分，无着色；1分，着色≤1/3；2分，1/3＜着色≤2/3；3分，着色＞2/3。两项结果相加＞3分为阳性。