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他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞ABCA1基因表(2)

2014-01-17 01:12 分别用含有150mL/L和50mL/L胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞汇合成片，胰酶消化后分别转入12孔板内，放入50mL/L CO2培养箱中37℃培养观察，待细胞生长成片时，用不含血清的培养基分别配置5μmol/L的辛伐他汀、20μmol/L普伐他汀、100μmol/L甲羟戊酸、10μmol/L的FPP、10μmol/L GGPP，充分混匀。分别设立空白对照组、辛伐他汀实验组(S)、普伐他汀实验组(P)、辛伐他汀+甲羟戊酸实验组(SM)、普伐他汀+甲羟戊酸实验组(PM)、辛伐他汀+FPP实验组(SF)、普伐他汀+FPP实验组(PF)、辛伐他汀+GGPP实验组(SG)、普伐他汀+GGPP实验组(PG)。放入培养箱继续培养48h。

　　1.2.2 逆转录反应 离心收集细胞，预冷PBS洗涤1次后用QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA。取1μg细胞总RNA，5×逆转录缓冲液5μL，RNasin(40u/μL)20u，10mol/L 4×dNTPs 2μL，用DEPC处理的H2O补足至23μL。混合均匀后于70℃反应5min，加入2μL反转录酶，37℃反应1h后，90℃热灭活5min，置-20℃贮存备用。

　　1.2.3 荧光定量RT睵CR检测ABCA1的表达 采用

　　ABI PRISM 7700 Sequence detector荧光定量PCR仪，以18S为内参。反应体系如下：吸取逆转录反应产物5μL，上、下游引物各10pmol/L，荧光探针5pmol/L，5×PCR缓冲液10μL，10mol/L 4×dNTPs 1μL，Taq DNA聚合酶1.5μL(2u/μL)，用灭菌纯水补足至50μL，在PE7000(美国ABI公司)上，93℃预变性3min后按如下条件进行循环：93℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 20s，共40个循环。设置阴性对照和阳性梯度对照，实验结果由电脑软件分析。引物序列如下，F：5′睺GGTTCTATGCCCGCTTGA3′;R：5′睞CCTTAGATCCCCCGACAAAG3′。

　　1.2.4 Western blot方法测定神经元和神经胶质细胞中ABCA1蛋白的变化 离心收集细胞，预冷PBS洗涤1次后，用Mem睵ER真核细胞膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白。采用Bio睷ad公司的垂直电泳装置电泳，并用半干法转膜。杂交按照KPL公司的Protein Detector T Western Blot Kit说明进行。ABCA1一抗购自NOVUS公司。

　　1.3 统计学处理 所有实验数据以

　　±s表示，使用Statistica软件(美国，StatSoft Inc)分析。采用Mann瞁hitney U检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　宫惠琳，李 扩，张冠军，等. 他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞ABCA1基因表达的影响

　　2 结 果

　　2.1 神经元实验组RT睵CR和Western blot结果 他汀类药物组与实验对照组相比，ABCA1基因的表达降低(其中辛伐他汀降低ABCA1基因达95%)，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。加入Mevalonate后，可以部分减弱辛伐他汀和普伐他汀的作用。但是，GGPP组、FPP组与他汀类实验组比较无显著性差异(图1);Western blot结果显示，在加入相同量的蛋白时，他汀类实验组的ABCA1蛋白表达显著降低(图2)。

　　2.2 神经胶质细胞实验组RT睵CR和Western blot结果

　　他汀类药物组与实验对照组相比，ABCA1基因的表达降低(其中辛伐他汀降低ABCA1基因75%)，

　　两组间差异有统计学意义(P<0.05)，但加入mevalonate、GGPP和FPP后，与他汀类实验组相比较无显著性差异(图3);Western blot结果显示，在加入相同量的蛋白时，他汀类实验组ABCA1蛋白表达降低(图4)。

　　3 讨 论

　　他汀类药物(statins)作为一种非常有效的降胆固醇、降血脂药物已经被广泛应用于临床，总体药效评价较好。以往研究认为，该药物可以降低血脂、降低心脑血管疾病的发病率、预防老年痴呆症的发生。但近年来研究提示，长期大剂量服用该药物可能造成脑细胞暂时性或者永久性的损伤，有些患者反而出现老年痴呆症的表现[79]。这种现象日益引起人们的重视。本研究证实使用他汀类药物能显著降低神经元和胶质细胞内ABCA1基因的表达，引起脑内胆固醇代谢异常，进而揭示了他汀类药物有可能是引起老年痴呆症的原因。

　　胆固醇的逆向转运(RCT)是指 HDL从肝外组织将胆固醇转运到肝脏进行代谢。通过这种机制，机体可将外周组织衰老细胞膜中的胆固醇转运到肝脏代谢并排出体外。胆固醇的逆向转运是一个由HDL介导，在胆固醇酯化酶、LCAT共同作用下完成的多步骤过程[10]。

　　ABCA1是一种整合膜蛋白。ABCA1基因位于常染色体9q31上。它所编码的蛋白称为ABCA1蛋白，属于ATP结合盒式转运体(ATP瞓inding cassette transporter, ABC)基因家族的一员。ABCA1广泛分布于人体多种组织，在胎盘、肝脏、肺、肾上腺和婴儿组织内高水平表达。在正常主动脉血管中没有发现ABCA1的表达，而在动脉粥样硬化的血管中则有该基因的表达[1112]。以往研究表明，肝脏和巨噬细胞ABCA1过表达与血浆脂质水平有密切关系，血浆胆固醇从巨噬细胞流出及血浆中HDL明显增加可大大减轻动脉粥样硬化的损伤[13]。临床研究表明，辛伐他汀和普伐他汀对大脑中载脂蛋白E(apoE)和磷脂蛋白转移蛋白(PLTP)的作用有所不同：辛伐他汀可以显著降低脑脊液中PLTP的活性，而普伐他汀却无此类作用;相反，普伐他汀使脑脊液中apoE水平下降明显，而辛伐他汀的作用却不明显[14]。由于血脑屏障的影响，两种他汀类药物进入血脑屏障的能力有所不同。辛伐他汀为脂溶性，较易透过血脑屏障;而普伐他汀为水溶性，透过血脑屏障较为困难。因此，