HPLC-MS/MS法测定兔血浆中黄芪甲苷的含量(2)

　　2.1专属性和检测限精密吸取兔混合空白血浆0.5mL，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液。在拟定分析条件下，进样20.0μL，得提取离子流图(图1)。另取兔混合空白血浆3份，每份0.5mL，分别加入10.0μL地高辛对照品溶液和5.0μL黄芪甲苷对照品溶液，按空白血样样品制备方法制备供试品溶液，在拟定分析条件下，进样20.0μL，得提取离子流图(图2)。由图1和图2可见，采用多级反应模式，拟定分析条件下，血浆中的其他物质不干扰黄芪甲苷的分析测定。逐级减小空白血浆中地高辛和黄芪甲苷对照品溶液的添加量，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液，拟定分析条件下测得血浆中黄芪甲苷的检测限为0.1ng/mL(S/N=3)。图1空白血浆供试品溶液黄芪甲苷和地高辛提取离子流图Fig.1 Extract ion chromatogram of astragaloside Ⅳ and digoxin in blank plasma

　　2.2线性范围取空白血浆8份，每份0.5mL，分别加入适量黄芪甲苷对照品溶液，使血浆中黄芪甲苷的浓度分别为50.0，25.0，12.5，5.0、2.5、1.0、0.5和0.05μg/mL，分别加入10μL地高辛对照品溶液，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液。在拟定分析条件下，分别吸取20μL，进样分析，测定黄芪甲苷和地高辛提取离子流图的峰面积。以两者峰面积的比值为纵坐标，黄芪甲苷的浓度为横坐标，进行回归。结果发现，在0.05～50.0μg/mL范围内，黄芪甲苷和地高辛提取离子流图峰面积的比值与黄芪甲苷的浓度呈非线性关系，但在0.5～50.0μg/mL却存在较好的线性关系。进一步在0.5～50.0μg/mL范围内，将黄芪甲苷和地高辛提取离子流图峰面积的比值与黄芪甲苷的浓度进行线性回归，得回归方程为y=0.02x+0.16，相关系数r=0.9994，提示血浆中黄芪甲苷的线性范围为0.5～50.0μg/mL。图2空白血浆加标供试品溶液黄芪甲苷和地高辛提取离子流图Fig.2 Extract ion chromatogram of astragaloside Ⅳ and digoxin in blank plasma with addition of5μL astragaloside Ⅳ and 10μL digoxin standardA：地高辛;B：黄芪甲苷。

　　2.3回收率

　　2.3.1提取回收率取空白血浆和水各3份，每份0.5mL，分别加入适量的黄芪甲苷对照品溶液和10.0μL地高辛对照品溶液，使空白血浆和水中黄芪甲苷的的浓度分别为为1.5、7.5和40μg/mL(高、中、低)，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液，进样20.0μL，测定黄芪甲苷含量。分别以血浆和水溶液中黄芪甲苷含量之比计算提取回收率，得高、中、低3个浓度黄芪甲苷的提取回收率分别为98.4%、101.2%和95.5%，提示黄芪甲苷具有较好的提取回收率。

　　2.3.2方法回收率分别精密吸取高、中、低3个浓度的空白血浆加标供试品溶液20.0μL，在分析条件下，进样分析，测定黄芪甲苷的含量。以测定量与加入量的比值计算方法回收率。结果发现黄芪甲苷的回收率分别为100.2%、96.3%和104.7%，提示方法具有较高的回收率。

　　2.4精密度实验分别取高、中、低3个浓度的空白血浆加标供试品溶液，在拟定分析条件下，1d内重复进样测定6次，测定黄芪甲苷的含量，计算得日内相对标准偏差分别为3.4%、6.7%和2.6%。将上述3个浓度的样品溶液分别在6d内连续测定6次，测定黄芪甲苷含量，计算得相对标准偏差分别为4.8%、6.3%和8.2%，表明方法具有良好的日内和日间精密度。

　　2.5稳定性试验

　　2.5.1冻融稳定性取添加有高、中、低3个浓度黄芪甲苷对照品溶液和10.0μL地高辛对照品溶液的空白血浆，在-20℃下冷冻24h，自然解冻后，按照空白血浆样品制备方法制备供试品溶液。拟定分析条件下，进样20.0μL，测定黄芪甲苷含量。然后将血浆样品重新冷冻24h，重复试验6次，计算冻融周期对黄芪甲苷稳定性的影响。结果发现，6个冻融周期对血浆中黄芪甲苷的测定无显著影响。

　　2.5.2短期稳定性取添加有高、中、低3个浓度黄芪甲苷对照品溶液和10.0μL地高辛对照品溶液的空白血浆，室温下放置2、4、6、8、10、12和24h后，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液。拟定分析条件下，进样分析，测定黄芪甲苷的含量。结果发现，样品在24h范围内稳定性良好。

　　2.5.3长期稳定性取添加有高、中、低3个浓度黄芪甲苷对照品溶液和10.0μL地高辛对照品溶液的空白血浆，在-70℃下冷冻贮存1、2、4、8周后解冻，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液。拟定色谱条件下，进样分析，测定黄芪甲苷含量，计算冷冻保存时间对稳定性的影响。结果发现，血浆样品-70℃下冷冻储存8周，对黄芪甲苷的测定无显著影响。

　　2.5.4后期稳定性取添加有高、中、低3个浓度黄芪甲苷对照品溶液和10μL地高辛对照品溶液的空白血浆，按空白血浆样品制备方法制备供试品溶液，室温下放置2、4、8、12、24和48h后，进样分析，测定黄芪甲苷含量。结果发现，血浆供试品溶液中黄芪甲苷在48h内稳定。

　　2.6样品测定分别取10、30和60min时间点采集的血浆样品，按含药血浆样品制备方法制备供试品溶液。拟定分析条件下，进样20μL，测定黄芪甲苷的浓度，结果表明，3个时间点所得含药血浆中黄芪甲苷的浓度分别为5.2、8.4和7.6μg/mL。

　　3讨论