亚洲带绦虫膜联蛋白B2基因的表达、纯化及免疫学(2)

　　带绦虫病的流行在我国西部一直是一个严重的公共卫生问题。每年由带绦虫病造成的健康和畜牧业经济损失上百亿，严重影响西部欠发达地区的社会发展。目前，亚洲带绦虫病的防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机制研究。图3重组蛋白的Western blotting 鉴定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：纯化蛋白与亚洲带绦虫患者血清的反应结果;2：纯化蛋白与牛带绦虫患者血清的反应结果;3：纯化蛋白与猪带患者血清的反应结果;4：纯化蛋白与亚洲带绦虫感染猪血清的反应结果;5：纯化蛋白与正常人血清的反应结果。

　　本实验通过生物信息学方法从已经构建好的亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出了一个膜联蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且预测出该基因位于胞浆，无跨膜区，二级结构基本上是以α螺旋为主。这些都符合膜联蛋白家族的共同特征[4]。根据膜联蛋白家族分布广泛，表达丰富且稳定的特性，可以推测其在绦虫的生理活动中可能起着重要的作用。

　　膜联蛋白是一个广泛存在的蛋白家族，在所有真核基因组中广泛表达。具有内部重复单位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+结合区域的特征，用以结合带有负电的脂质。虽然它为钙结合蛋白，但是在结构上却没有EF手，而且在和Ca2+结合后，还可以与磷脂再次结合而发挥生物学效应。例如，细胞的胞吞胞吐，离子通道的形成，调节磷脂酶A2的活性及细胞内外Ca2+浓度、抗炎症反应等。在长期的生物进化过程中，膜联蛋白家族各成员在生物学特性和生理功能方面表现出非常复杂的关系，且在研究过程中发现，annexins没有信号肽，没有跨膜结构，是一个典型的细胞内蛋白。但是，却有学者发现它可以与细胞外基质发生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制肿瘤[8]等。最新的研究报道，当将其作为疫苗的候选因子时，可以消除一些寄生于哺乳动物体内的寄生虫。此外，学者们认为膜联蛋白是维持细胞膜表面结构和信号转导功能的重要蛋白。并可能具有激活纤维蛋白酶原的功能，有助于破坏宿主的结缔组织，使虫体抗原更加容易进入宿主机体，诱发免疫应答。因此，对该基因的研究有助于进一步了解它的生物学功能及开辟预防治疗寄生虫病的新途径[9-10]。

　　目前，Annexins B2已经在猪囊尾蚴的研究被发现并命名，但是具体的生理功能还不清楚，且在亚洲带绦虫研究领域还是空白。因此，本研究将亚洲带绦虫成虫annexins克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒，在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，上清中有微量的表达，说明annexins主要表达在包涵体中。因此，进一步溶解包涵体[11]，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。此外，还尝试性的用上清过柱纯化并用蔗糖进行蛋白浓缩，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的，可用于不同抗原的比较和定量。其检测结果表明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应且在绦虫中的诊断特异性不高，推测其不能作为免疫诊断抗原的合适候选分子。但是，其具有免疫活性的高效表达。由此可推测它是一个具有开发潜力的基因。总之，本项研究填补了该蛋白在亚洲带绦虫研究领域的空白，也为进一步研究该基因的生物学功能及在诊断尤其是疫苗研究方面奠定了基础。

【参考文献】 （科教论文网 lw.NsEac.com编辑整理）
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　　\[5\]CHOI SH, KWON SR, LEE EH, et al. Molecular cloning, functional characterization and localization of an annexin from a fish gill fluke microcotyle sebastis (Platyhelminthes: Monogenea) \[J\]. Mol & Bioche Parasitol, 2009,163(1):48-53.

　　\[6\]高奋堂，曹云山，徐义先，等. 氟伐他汀对人外周血单个核细胞膜联蛋白A1表达水平的影响 \[J\]. 临床心血管病杂志, 2006, 22(4):209-211.

　　\[7\]王义会，闫强，王平，等. 膜联蛋白B2基因的克隆及其真核表达载体的构建 \[J\]. 动物医学进展, 2007, 28(3):31-33.

　　\[8\]朱逢佳，曾苏，曹江. 膜联蛋白-1与肿瘤\[J\]. 细胞生物学杂志, 2008, 30(5):581-585.

　　\[9\]ZHANG Y, WANG KH, GUO YJ, et al. Annexin B1 from Taenia solium metacestodes is a newly characterized member of the annexin family \[J\]. Biol Chem, 2007, 388(6):601-610.

　　\[10\]WU D, GUO YJ, LIN Y, et al. Protective immunity induced by DNA vaccine of Cysticercus cellulosae antigen \[J\]. Acad J Sect Mil Med Univ, 2000, 6(21):508-510.

　　\[11\]马歇尔DR，门永JT. 蛋白质纯化与鉴定实验指南 \[M\]. 第1版，北京：北京科技出版社, 1999:148-151.