探讨体外培养人牙周膜细胞方法论文(2)
2014-06-01 01:17
导读：1.3.4 描绘细胞生长曲线 取3块 24 孔板，分别取3种方法培养的第5代细胞，调整细胞浓度为1×104个/ml接种于 24 孔板，每孔100 μl，CO2培养箱内培养4 h后每孔加
1.3.4 描绘细胞生长曲线
取3块 24 孔板，分别取3种方法培养的第5代细胞，调整细胞浓度为1×104个/ml接种于 24 孔板，每孔100 μl，CO2培养箱内培养4 h后每孔加0.5 ml培养液继续培养，每天每组各取 3孔的细胞作细胞计数，连续观察8 d，绘制细胞生长曲线。
2 结果
2.1 形态学观察3种方法培养的hPDL形态学上无太大区别，均呈长梭形或星形，胞突细长，胞体丰满，胞浆均匀，中央有圆形或椭圆型的胞核，细胞呈放射状、漩涡状排列（见图1～3）。HE 染色胞核嗜碱性，胞浆嗜伊红 （见图4）。
2.2 免疫组织化学鉴定结果免疫组织化学实验显示细胞波形丝蛋白染色阳性，角蛋白染色阴性，证明为中胚层组织来源（见图5、图6）。
2.3 3种方法培养的hPDL生长情况
2.3.1 组织块法
牙周膜组织块经静置贴壁后，一般 8～16 d组织块边缘有细胞开始游出，以组织块为中心成放射状、漩涡状生长，生长的细胞以1∶2 传代培养，最初5代的细胞3～5 d即可长满培养瓶底，生长状态较活跃，核分裂相多见；6～12 代细胞，7～10 d汇合，细胞增殖稳定。本实验用组织块法培养牙周膜细胞培养了20例，成功1例，成功率5%。
2.3.2 酶消化组织块法
用此方法所培养的20例中，有4例在5～10 d内观察到细胞游出，2例传代成功。细胞以组织块为中心呈放射状排列生长。传代后的细胞生长旺盛，状态良好，原代培养成功率为10%。图1 组织块周围长出的牙周膜
2.3.3 全牙消化法
最初消化下来的细胞为圆形，呈悬浮状态。24 h 后细胞开始贴壁，48 h 后几乎全部贴壁。贴壁后的细胞2～3 d开始伸展变形，多数细胞形态呈长梭形或星形，少数呈扁平多角形。从第6天起，细胞生长加速，长梭形及星形细胞增殖活跃，多角形细胞生长相对较缓慢，细胞大约经历12 d后开始形成单层，长梭形细胞占绝对优势。细胞传至 2～3代时可基本去除上皮样细胞，4～10 代细胞生长状态较好，核分裂相多见，3～5 d可长满培养瓶底。用此方法原代培养20例，有4例传代成功，成功
