谈乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建(2)
2014-06-10 01:23
导读：2.4 重组腺病毒Ad-HBx的鉴定 PCR鉴定结果证实重组病毒Ad-HBx基因组中含有目的基因，电泳显示465 bp的单一条带(图3)。 3 讨 论 HBx基因编码的X蛋白是一种多功能
2.4 重组腺病毒Ad-HBx的鉴定 PCR鉴定结果证实重组病毒Ad-HBx基因组中含有目的基因，电泳显示465 bp的单一条带(图3)。
3 讨 论
HBx基因编码的X蛋白是一种多功能病毒调节蛋白，具有广泛的基因转录调控作用，并能与宿主细胞的多种蛋白质直接作用，从而调节基因表达及宿主细胞蛋白质功能，进而影响病毒的复制、宿主细胞信号转导、细胞增殖与分化、细胞凋亡及癌变等[3]。
本实验采用限制性内切酶从重组质粒pcDNA3.1-HBx得到HBx基因，应用pAdEasyTM重组腺病毒系统在原核细胞大肠杆菌BJ5183内进行同源重组[4]， 大大提高了病毒的重组效率。AdEasyTM重组腺病毒系统中腺病毒骨架质粒含有不完整的腺病毒基因，缺失E1区(1-3533)和E3区。E1区为病毒复制所必需，人胚肾细胞293细胞可以补充E1区。重组穿梭质粒含有目的基因HBx基因、CMV启动子、GFP基因、卡那霉素(Kana)耐药基因、限制性内切酶PacⅠ位点和PmeⅠ位点。将穿梭质粒用PmeⅠ酶切线性化后，电转化至含有骨架质粒的感受态细菌BJ5183中进行同源重组[5]，利用卡那霉素抗性筛选重组体。重组成功的质粒用PacⅠ线性化，转染293细胞，得到可表达HBx蛋白的重组腺病毒载体。观察其在293细胞中GFP的表达情况，检测HBx蛋白的表达，从而确定重组腺病毒Ad-HBx构建成功。本实验构建的携带HBx基因的重组腺病毒载体，具有转染效率高、易检测观察(GFP为报告基因)的优点，为下一步研究HBx对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程的机制建立基础。
【参考文献】
[1] Hwang GY, Lin CY, Huang LM,et al. Detection of the hepatitis B virus X protein (HBx) antigen and anti-HBx antibodies in cases of human hepatoce
