谈乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建
2014-06-10 01:23
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摘要： 目的 为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系，构建HBx基因
摘要： 目的 为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系，构建HBx基因重组腺病毒载体。方法 应用pAdEasyTM腺病毒载体系统，首先从质粒pCDNA3.l-HBx中酶切得到HBx基因，插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，得到pAdTrack-CMV-HBx，将其PmeⅠ酶切线性化后，转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中，通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd-HBx，经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞，产生重组腺病毒颗粒Ad-HBx。结果 PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad-HBx构建成功，在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论 成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体，为后续研究奠定了基础。
关键词： 乙型肝炎病毒;HBx基因;腺病毒载体
原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤之一，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) 感染与HCC的发生密切相关，而HBV X基因编码的HBx蛋白在HBV相关性肝癌发生发展中起关键作用[1]。本实验采用pAdEasyTM重组腺病毒系统，构建HBx基因重组腺病毒载体(Ad-HBx)，为进一步研究 HBx 基因对肝癌发展的影响提供可靠的基因转移工具。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体质粒pCDNA3.l-HBx由本实验室构建并保存[2]， pAdTrack-CMV腺病毒质粒、含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌、人胚肾293细胞株及空白对照腺病毒Ad由徐州医学院生物化学与分子生物学研究中心胡书群博士惠赠。PmeⅠ酶、PacⅠ酶购自 NEB，其余限制性核酸内切酶及T4DNA 连接酶、PCR试剂盒、质粒DNA回收纯化试剂盒为美国Promega公司产品，Effectence转染试剂盒为德国Qiagene公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 pAdTrack-CMV-HBx重组穿梭质粒的构建 用HindⅢ和EcoRⅤ双酶切pcDNA3.1-HBx，获取HBx基因，克隆到腺病毒载体pAdTrack-CMV(同样HindⅢ/EcoRⅤ双酶切)中。得到重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx。经PCR、酶切验证后送invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司测序。
1.2.2 pAdTrack-CMV-HBX与pAdEasy的同源重组 将正确重组的穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx用PmeⅠ酶切线性化，电转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183细菌。卡那霉素选择性培养基筛选阳性克隆，挑取最小的克隆扩增培养，提纯质粒。用PacⅠ酶切鉴定质粒，鉴定成功的重组子再次转化感受态DH5α细菌，筛选阳性克隆并提取纯化，得到含HBx基因的重组腺病毒质粒pAd-HBx。
1.2.3 重组腺病毒在293细胞内的包装和扩增 经PacⅠ酶切线性化的重组腺病毒质粒pAd -HBx转染293细胞，按照Effectence转染试剂
说明书操作。37℃、5% CO2培养箱中孵育，24～48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达，7～10天后收集包装细胞，反复冻融4次以收获重组腺病毒Ad-HBx，将病毒冻融上清液反复感染293细胞以大量扩增并收获病毒。
1.2.4 重组腺病毒Ad-HBx目的基因鉴定 5 μl病毒上清液加上10 μl PCR-grade Protease K，55℃消化1 h，然后煮沸样品5 min，离心后取1～2 μl进行PCR反应，证实重组腺病毒基因组中含有HBx基因。
2 结 果
2.1 重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx的鉴定 用HindⅢ/EcoRⅤ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱以及采用HBx基因全序列的上下游引物其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱上都可见一条465 bp的条带，与目的基因HBx的DNA片段一致。测序结果也证实重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBx中HBx的碱基序列与文献报道一致。
2.2 重组腺病毒表达质粒pAd-HBx的鉴定 用PmeⅠ酶切线性化pAdTrack-CMV-HBx与pAdEasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，结果得到重组腺病毒载体质粒pAd-HBx。用PacⅠ酶切重组腺病毒表达质粒pAd-HBx，0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，有30 kb和3.0 kb的2个条带(图1)，证实穿梭质粒和骨架质粒同源重组成功。
（转载自http://zw.ＮＳＥaＣ.com科教作文网） 2.3 重组腺病毒Ad-HBx的包装 含重组腺病毒的质粒pAd-HBx转染包装细胞293，在24～48 h后，荧光显微镜下可观察到GFP的表达(图2)，表明重组腺病毒在293细胞中已开始病毒包装。7～10天后可观察到细胞病变(CPE)，大部分包装细胞肿胀脱落。
