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信号转导和转录活化因子-3在大鼠急性肺损伤中表

2014-09-20 01:39 弓清梅，任文霞，赵 鹰，李建强，刘卓拉【摘要】 目的 探讨大鼠急性肺损伤（ALI）过程中，信号转导和转录活化因子-3（STAT3）的活化规律，及其与细胞因子白介素-6（IL-6）的相关性。方法 健康雌性Wistar大鼠（190±10）g 50只，随机分为生理盐水(NS)组(10只)，尾静脉注射NS，2h后处死；LPS模型组（40只），尾静脉注射内毒素（LPS）（5mg/kg），分别于注射LPS后1、2、4、6h时取材。原位杂交法测定肺组织中STAT3的基因表达，放免法检测血和肺泡灌洗液（BALF）中IL-6的浓度，将二者进行相关性分析。结果 急性肺损伤后，在多种肺细胞中均可观察到STAT3的基因表达增加，包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞以及炎性细胞；正常肺组织STAT3基因弱表达，LPS损伤后肺组织中STAT3的基因表达逐渐增高，4h达峰值，随后其水平逐渐下降，血及BALF中IL-6的浓度变化与STAT3的基因表达相一致，且二者之间明显相关。结论 在急性肺损伤的早期伴随有信号转导JAKs- STAT3通路的激活，IL-6是STAT3通路活化的机制之一。 【关键词】 信号转导；转录活化因子-3；急性肺损伤；白细胞介素-6 【Abstract】 Objective To investigate the activation law of signal transducers and activators of transduction-3(STAT3) and whether cytokine IL-6 can activate STAT3 in acute lung injury (ALI) of rats. Methods 50 female Wistar rats (190±10g) were randomly divided into NS group（n=10），ALI groups(n=40). After intravenous injection of endotoxin (5mg/kg) from tail vein，animals were killed at 1th，2th，4th and 6th hour. Detection of STAT3 gene expression of lung tissue with in situ hybridization(ISH) and measurement of the concentration of IL-6 in blood and BALF with radioimmunoassasy.Results LPS treatment resulted in STAT3 activation throughout the resident lung cells，as well as in the recruited inflammatory cells. STAT3mRNA expression in lung constitution increased gradually，peaked at 4th hour and started to decrease at 6th hour. The change of IL-6 concentration in blood and BALF is consistent with the changes of STAT3mRNA expression，and the two is positively correlated. Conclusion The experimental result shows the JAK-STAT3 pathway is activated at early phase of ALI; IL-6 may activate STAT3 pathway at early phase of ALI. 【Key words】 signal transducers；activators of transduction-3; acute lung injury; IL-6 信号转导和转录活化因子（signal transducers and activators of transduction，STAT）家族作为潜在的细胞转录因子介导了多种生物学效应，其中STAT3是 STAT家族的重要成员，它可以被多种细胞因子和生长因子活化。近年来对信号转导的研究发现，STAT蛋白家族在急性肺损伤时有表达，其中STAT3蛋白是以一种抗炎性蛋白存在，对急性肺损伤起到一定的自身保护作用［1］。本实验以内毒素（LPS）造成急性肺损伤模型，来观察肺组织中STAT3的基因表达规律及其可能的激活因子。 1 材料与方法 1.1 材料 雌性健康Wistar大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供；内毒素（lipopolysaccharide，L-2880 055： B5）、DEPC水为美国Sigma公司产品；STAT3原位杂交试剂盒、DAB显色液及原位杂交盖玻片均购自武汉博士德公司；碘（125I）IL-6放免试剂盒购自北京北免东雅生物技术研究所。 1.2 方法 1.2.1 动物分组及模型 50只雌性健康Wistar大鼠（190±10）g，随机分为5组。用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉：（1）生理盐水对照组（10只）： 尾静脉注射生理盐水（2ml/kg体重），约2h后处死，采集标本；（2）LPS模型组（40只）：尾静脉注射LPS（5mg/kg体重），分别于注射LPS 1、2、4、6h后活杀大鼠采集样品，各时相点各10只。各组动物剖腹，腹主动脉取血后处死。留取血清冻存于-20℃冰箱保存备用。经气管插入12号针头管于左侧肺组织，以4℃生理盐水分别按1.5、1、1ml灌洗3次，缓慢回抽灌洗液，以1500r/min离心10min，取上清冻存于-70℃冰箱保存待测IL-6值。取右下肺组织约0.5cm×0.5cm大小组织块，固定于10%中性甲醛，石蜡包埋后行（HE）染色及病理学观察。取右中肺组织约0.3cm×0.2cm大小组织3~4块，固定于4%多聚甲醛（内含0.1轕C水），6h后石蜡包埋。 1.2.2 原位杂交检测STAT3mRNA的表达 4%多聚甲醛固定的肺组织经石蜡包埋切片，置于经10%多聚赖氨酸（内含0.1% DEPC水）处理的载玻片上，切片厚度6μm，60℃烘烤过夜。常规脱蜡至水；3%过氧化氢溶液孵育10min，消除内源性过氧化氢酶活性；3%枸橼酸新鲜配置的胃蛋白酶室温处理20min；滴加预杂交液，40℃孵育4h；滴加杂交液，以原位杂交专用盖玻片覆盖，湿盒40℃温箱孵育过夜；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60min；滴加SABC，37℃ 20min；滴加生物素化过氧化物酶，37℃ 20min；DAB溶液显色23min，蒸馏水充分洗涤；苏木素轻度复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照以PBS缓冲液代替杂交液，其他步骤不变。 1.3 结果判定 阳性染色为细胞浆内棕黄色着色颗粒，细胞核内少量着色。采用Mias-2000细胞图像分析仪对染色结果行半定量分析，在显微镜(×200)下以相同外部条件(亮度)摄取bmp图像，每张切片摄10副，STAT3mRNA原位杂交图像行平均光密度值测定，每张切片取均值。 1.4 血及支气管肺泡灌洗液中IL-6的测定 将冻存的血清及支气管肺泡灌洗液置于室温下复融、混匀，采用放免法检测，操作严格按照试剂盒说明书。该试剂盒灵敏度：＜50pg/ml。 1.5 统计学分析 实验数据采用SPSS 13.0软件包进行分析，数据以（x±s）表示，采用q检验、方差分析和直线相关分析，P