葛根芩连汤上清液与沉淀中异黄酮类成分指纹图

【关键词】葛根芩连汤；,,指纹图谱；,,上清液；,,沉淀

　　摘要：目的通过应用三维高效液相色谱，建立葛根芩连汤上清液和沉淀中异黄酮指纹图谱的方法，明确其上清液和沉淀中异黄酮类成分的异同，以便进一步探讨该方的配伍规律。方法葛根素、大豆苷元用甲醇溶解制成对照品溶液，葛根药材水煎液、葛根芩连汤上清液、沉淀用二甲基亚砜溶解制成供试品溶液，采用三维高效液相谱对葛根芩连制剂进行指纹图谱实验研究，流动相为甲醇水乙腈梯度洗脱，扫描波长为200～400nm。结果在梯度洗脱条件下，葛根芩连汤上清液的HPLC指纹图谱中有6个标识性共有峰，葛根芩连汤沉淀的HPLC指纹图谱中有4个标识性共有峰。但峰面积仅占上清液的8%（以葛根素计）。结论葛根芩连汤配伍产生的沉淀中亦有异黄酮类有效部位，但与上清液比较，含量较低。说明君药葛根中异黄酮类成分与方剂中的其他物质络合而产生沉淀，且该沉淀溶于二甲基亚砜。

　　关键词：葛根芩连汤；指纹图谱；上清液；沉淀

　　葛根芩连汤原载于东汉张仲景《伤寒论》中，由葛根、黄芩、黄连、炙甘草4味中药组成。其处方为：葛根15g，黄芩9g，黄连9g，甘草(炙)6g。其中葛根为君药，黄芩、黄连为臣药，炙甘草为使药。功效主要是表里双解，清热止痢。中药配伍在煎煮过程中，其成分发生复杂的变化，其中沉淀反应是中药配伍共煎时常见的变化。日本学者于1978年首次报道黄连配伍甘草、大黄时小檗碱等生物碱在煎剂中的含量大幅度下降［1］。其沉淀能溶于二甲基亚砜，部分溶于吡啶、稀酸、稀碱，微溶于冷甲醇、乙醇，不溶于氯仿、石油醚、在热甲醇中能不断溶解，冷后又生成沉淀［2］。沉淀使煎液中有效成分的含量降低，且有研究表明，黄连黄芩配伍产生的沉淀，能够在胃肠内溶解［3］，但葛根芩连汤配伍后究竟是哪些成分发生沉淀反应，目前尚未有明确的结论。本实验试图通过指纹图谱的方法，探明其上清液与沉淀中异黄酮成分的异同，以明确沉淀物中是否有异黄酮类成分。

　　1仪器与试药　

　　美国惠普HP1100高效液相色谱仪，G1315A紫外可见光二级管阵列检测器，离心机（北京医用离心机厂），甲醇(分析纯，天津大茂学试剂厂)、甲醇（色谱纯，MERCK)，乙腈(色谱纯)，葛根素对照品753200007、大豆苷元对照品1502200101(中国药品生物制品检定所)；葛根、黄芩、黄连、甘草药材由广东省致信药材公司提供,经本校中药鉴定教研室刘传明讲师鉴定,分别为豆科植物野葛PuerarialobataOhwi,唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi干燥根茎,毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.干燥根茎,豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根茎(蜜炙)。

　　2方法

　　2.1葛根芩连汤标准汤剂供试品溶剂的制备葛根15g，黄芩9g，黄连9g，甘草6g，烧杯中加水400ml,先煎葛根20min,余药共煎30min,煎两次,趁热120目滤布滤过,合并滤液。90℃定容至1000ml,静置室温后，于冰箱4℃内静置24h，取出，离心以3000r/min，得到上清液，定容到1000ml，为供试品溶液1；沉淀于烘箱内50℃干燥24h后，加适量二甲基亚砜使溶解，定容到1000ml，过滤，得供试品溶液2。

　　2.2色谱条件甲醇∶水∶乙腈梯度洗脱［4，5］检测波长的选择。结果见表1。依据DAD检测的三维图谱,选择可将全谱物质均能检测到的250nm作为最后的检测波长(图1～3)。

　　表1梯度洗脱条件（略）

　　图1葛根药材水煎液（略）

　　图2葛根全方上清液（略）

　　图3葛根芩连全方沉淀（略）

　　2.3对照溶液的制备

　　2.3.1对照药材溶液的制备取葛根药材15.09g，水煎煮2次，煎煮时间分别为30，20min，滤过，煎煮液定容到1000ml，即得。

　　2.3.2对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷元各5mg，于50ml容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得。 论文网在线

　　2.4样品测定精密吸取各溶液10μl，注入高效液相色谱仪（HPLC）中，参照高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行实验，以对照药材为参照色谱，测定并记录色谱图，以中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版采用多点校正的方法进行计算分析。