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论ＤＨＰＬＣ技术在基因突变检测上的应用

2016-01-06 01:07

　　1　DttPLC技术原理
　　
　　变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高通量、自动化的基因突变检测技术。该技术已在医学、癌症、药物等研究领域开展应用，与SSCP和DNA直接测序等突变检测技术相比，DHPLC具有灵敏性更高，特异性更强，廉价省时等优点。
　　DHPLC技术的原理是基于未解链的和部分解链的双链DNA在部分失活条件下具有不同保留的性质。这种部分失活条件可以采取升高温度的手段获得。所有基因组DNA的单拷贝均可通过PCR反应大量扩增，杂合子个体的DNA经扩增产生异源双链，由于错配位点的氢键被破坏，因此在异源双链上形成“鼓泡”，导致它与纯合子个体的DNA扩增产物——完全匹配的同源双链的解链特征不同。在部分加热变性的条件下，异源双链DNA分子更易于解链形成Y形结构，与固定相的结合能力降低。当流动相中乙腈浓度梯度增大时，异源双链将先于同源双链被洗脱出来，带有突变序列的样品呈现出异源双链和同源双链混合物的峰形特点，而不含突变序列的样品则只有同源双链的峰形。据此可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段，从而提供有无突变的信息。
　　
　　2　DHPLC技术在突变基因诊断中的应用
　　
　　基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变，主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入，它是导致基因型疾病的重要原因之一。基因突变在生物医学研究中，尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。
　　随着人类基因组整体测序计划的发展，探索基因突变的任务变得十分迫切。DHPLC技术自最早被用于分析人Y染色体单核苷酸多态性位点(SNP)以进行人种进化的遗传性研究；此后还用于筛查致病基因突变位点、分析单核背酸多态性以及基因启动子CpG岛甲基化修饰改变等研究；因其灵敏性及准确度均较高，操作实现了半自动化，检测周期短、费用低，尤其适合于基因结构复杂而无突变热点或突变频率低于20％的单基因变异，以及多基因致病突变。

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　　(1)散发性卵巢癌p53基因突变定位于17染色体的p53基因是目前研究得最广泛的抑癌基因，迄今发现的人类肿瘤的2500种基因突变中，p53蛋白的393个氨基酸就有280个位点存在突变，其直接的后果是导致氨基酸的改变，最终使p53蛋白失活，丧失抑癌作用。杜明和丰有吉，利用DHPLC来检测50例散发性卵巢癌p53基因外显子5，8的突变，18例突变都可以使用DHPLC的方法发现，没有假阳性和假阴性。说明DHPLC可以用于临床筛查基因突变，并且对于异质性肿瘤而言，DHPLC检测基因突变无疑是最可靠的。
　　(2)胃癌组织基因突变鲁狲、徐惠绵、任群等人利用DHPLC对39例胃癌组织及血清中p53基因突变进行检测，并测序验证。在他们的研究中p53基因的突变率为21％(8/39)；其中肠型胃癌突变率40％(6/15)明显高于弥漫型胃癌8.33％(2/24)(P<0.01)；发现既往未见报道突变3例。这充分说明了DHPLC是一项较好的检测胃癌组织中基因突变的筛查方法
　　(3)汉族人I型多囊肾致病基因突变张树忠等人，通过采用DHPLC技术检测汉族人常染色体显性多囊肾病(AD－PKD)I型致病基因PKDl的突变：以来源于19个ADPKD家系的67名成员血样标本的基因组DNA为模板，通过长链PCR和巢式PCR联合扩增的方法扩增PKDl全编码区，然后采用DHPLC方法进行初步筛查，将存在异常色谱图的扩增产物经核苷酸测序，确定突变的具体位点和类型，共检测出14个致病突变，包括10个错义突变、1个插入突变、1个缺失突变、2个无义突变。他们实验结果充分说明了DH－PLC方法可以作为更为有效筛查汉族人ADPKDPKDl突变位点的检测途径。
　　(4)乳腺癌BRCAl基因突变BRCAl基因为“乳腺癌1号基因”，位于17q21，有22个编码外显子。目前已经发现约40％～50％的遗传性乳腺癌和卵巢癌患者BRCAl基因发生突变。李丹等利用聚合酶链反应PCR扩增BRCAl基因，该扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，直接进行DH－PLC分析，从124例乳腺癌患者中共发现9种突变，确定了9种乳腺癌患者可能发生的突变类型，为今后临床应用DH－PLC对高危人群BRCAI基因进行早期基因检测提供了9个位点，所有DPHLC检测显示峰型异常的样品经测序证明均存在突变或者SHP，证明该技术阳性检测率为100％。且具有操作简单、快速、敏感、准确且经济等特点。

　　3　DHPLC技术与其他技术在突变基因诊断中的联合应用 您可以访问中国科教评价网（www.NsEac.com）查看更多相关的文章。
　　
　　目前在核酸分析领域与HPLC联用的检测手段有紫外(ultraviolet photometric detector，UV)、荧光(fluorescencedetector)、质谱(mass Spectrometry，MS)等。其中紫外检测器(UV)凭借其良好的通用性成为应用最为广泛的检测器，但灵敏度不高的弱点使其使用受到一定的限制。在核酸分析和一些突变扫描方法中有时需要更高的灵敏度，这时具有更高灵敏度和选择性的荧光检测器成为首选。但是荧光检测器要求使用荧光标记物，且通常使用的染料如吖啶黄、溴化乙锭是有毒物质。Scalano实验室开发出SYBR Green，染料不仅具有更好的灵敏度，而且使用更安全。激光诱导荧光是目前灵敏度最高的检测方法之一。Hecker等采用荧光标记PCR引物、激光诱导荧光方式进行检测，证明DH－PLC方法可以区别含量相差500倍的两个等位基因，这使多份样本的混合检测成为可能。同时荧光标记单链，使色谱图的解释变得更加容易。美国Transgenomie公司在WAVEOR核苷酸片段分析系统技术平台基础上，开发出一种后荧光检测技术。在所有分析条件不变的情况下，被检测的核酸片段经DHPLC分离之后在混合室中与荧光试剂混合，然后进行检测，不仅可以提高灵敏度上百倍，而且不需要昂贵的荧光标记引物。近年来电喷雾离子化一质谱(EIS－MS)作为一种重要的结构分析工具与IR－RP－HPLC联用也已应用于核酸分析领域，该联用技术不仅可以确证被分离的单链DNA的成分特性，还可以确证扩增的PCR产物的基因型。众所周知，在核酸的质谱分析中为了获得高置信度的分析结果，对分析物进行适当的脱盐和去除小分子量杂质是必不可少的，这也正是HPLC－MS的魅力所在，但质谱的高成本使该项技术较难推广使用，
　　
　　4　总结
　　
　　DHPLC用来检测DNA突变和单核酸多态性，可以取代传统分子生物学技术，不需要制备凝胶，检测DNA片段做到了全自动、高效、快速、准确，在疾病相关基因突变检测方面提供了有效的技术手段，是一种快速有效的基因突变筛查方法。DHPLC技术也有不足之处：对PCR要求很高；不能直接检测出纯合突变，只能提供个体样本有无突变的信息，但无法得出具体的突变类型；当有多个片段需要检测时，由于有多个解链温度，需要多步检测，增加了工作量等。尽管如此，在目前的检测手段中，DHPLC仍是一种快速、高效、准确、经济及半自动化筛查基因杂合突变的工具，优于测序等其他分子生物学方法，相信在未来的基因组学研究领域中必将继续发挥重要的作用。