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1 引言 以前的研究表明，松果体素（melatonin）主(2)

2013-07-08 01:38
　　
　　2 材料与方法
　　
　　2.1 动物和试剂
　　实验中所用的新生（1 天，SD）大鼠购于安徽省实验动物中心。母鼠在20－23℃和12:12 光照/黑暗周期（7：00 开灯，19：00 关灯）环境中饲养。动物饲养，关爱和应用都遵循相关法律规则，并且尽量减轻动物的疼痛。
　　细胞培养基 Dubucco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 和胎牛血清（fetal bovineserum, FBS) 购于Gibco 生物公司。缓 冲 液HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 谷氨酰胺（L-glutamine）, 青霉素（penicillin）, 链霉素（streptomycin）, 兔抗5－羟色胺（rabbit anti-serotonin）, 胶原酶（collagenase）, 维生素C（Ascorbic acid）购于Sigma-Aldrich 公司。 Melatonin Research RIAkit 购于 Labor Diagnostika Nord (LDN, Germany)公司。
　　2.2 松果体细胞培养
　　按照以前的文献所描述的方法体外培养原代的大鼠松果体细胞[17]。首先取出生1 天的SD 幼鼠，75％乙醇消毒，无菌条件下取出松果体，放入冷D-PBS 溶液中。后用0．25％胰酶和100u/ml 胶原酶消化液37℃消化，20 分钟后用含10％胎牛血清的培养基中止消化，轻轻吹吸细胞数次，将之打散成单细胞。然后1000 转离心5 分钟，弃上清。细胞沉淀用完全培养基（DMEM, 10%胎牛血清, 55 μg/ml 丙酮酸钠, 2mM 谷氨酰胺（L-glutamine）, 25mMHEPES, 0.1mg/ml 维生素C, 4 mg/ml 葡萄糖, 100 units/ml 青霉素，0.1 mg/L 链霉素）重悬，并按3х105/ml 的密度接种于6 孔板，并于37℃，5％CO2 条件下培养。
　　2.3 收集细胞培养上清
　　当大鼠原代松果体细胞数达到106 时，收集细胞培养上清，检测上清中的松果体素水平。为了检测松果体素的昼夜节律，大鼠原代松果体细胞的培养上清在培养3，6，9，12，15天后分别在白天6：00，8：00，10：00，12:00,15:00 和夜晚18：00，20：00，22：00，1：
　　00，4：00 收集。收集细胞培养上清时注意避光，并且，收集细胞培养上清的时间不超过3分钟。随后，收集的细胞培养上清在4℃12000rpm 离心10 分钟。最后，尽快将细胞培养上清放于－80℃避光保存，以备检测用。
　　2.4 松果体素放射免疫分析（RIA）
　　大鼠原代松果体细胞培养上清中的松果体素用放射免疫分析（RIA）法检测，检测步骤按照公司推荐的进行。检测试剂盒中标准品的松果体素水平的检测范围为0pg/ml-1000pg/ml。松果体素检测的标准曲线高度相关，相关系数为0 .999。为了减少误差，每个样本均检测两次。松果体素与N－已酰－5－羟色胺及5－羟色胺的交叉反应分别为0.8%和<0.01%。松果体素检测试剂盒的灵敏度是0.8 pg/ml。
　　2.5 统计分析
　　体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体节律用complex cosine function (CCF)分析[18]。曲线的拟合使用非线形回归（nonlinear regression）分析。当p<0.1 时被认为具有显著性差别。
　　
　　3 结果
　　
　　在这篇文章中，我们分别收集了体外培养的大鼠松果体细胞在白天 6:00, 8:00, 10:00,12:00 15:00, 和夜晚 18:00, 20:00, 22:00, 1:00, 4:00 各个时间点的培养上清，并用放射免疫方法（RIA）检测了各个时间点松果体细胞培养上清中的松果体素水平。预期值用平均值±标准差来表示。每一组实验数据用下列的公式拟合：Y(x) =M+ A24*cos(x – ф24) + A12*cos (2x– ф12)。在这个公式中，x 代表时间点（in radians）。Y 代表在各个时间点x 松果体素水平的预期值。M 代表平均值。A24 和ф24 分别是 24 小时期间的波幅和相位，而A12 和ф12 分别是12 小时期间的波幅和相位。
　　在空的加有胎牛血清的完全培养基中发现有极少量的松果体素(数据未显示)。CCF 统计分析结果表明，大鼠松果体细胞分泌的松果体素在完全黑暗的环境下体外培养了3，6，9天后各个参数明显符合CCF（p<0.1），具有昼夜节律。它提示了大鼠松果体细胞松果体素的分泌具有内在节律。但是，这种内在节律在体外培养12 天的时候就消失了。松果体素的波幅第3 天和第6 天的波幅较低，而在第9 天的时候达到最高。但是，体外培养的大鼠松果体细胞分泌的松果体素在第3 天，第6 天，第9 天，第12 天的24 小时平均水平依次升高，在第12 天达到最高，而到第15 天又开始降低。