浅谈基因改造中快速PCR定点突变方法及研究

铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因为可以消除O-  ・2而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症，但是由于多种因素影响，尤其是Cu，Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。定点突变技术是改造、优化基因常用的手段，也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法，在医学上还可用于基因治疗等。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等〔1〕。但由于这些方法操作繁琐，意外突变多等缺陷，使定点突变的实验受到一定限制。本研究采用一种近年来新的定点突变技术―快速PCR定点突变方法成功地对hCu，Zn-SOD进行了基因改良(将hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子，以提高其稳定性)，同时对该定点突变技术要点进行探讨。

　　1   材料

　　11   菌株与质粒   E.coli DH5α，由本实验室保存。质粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约33kb)由本实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。

　　12   主要试剂   Pfu高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南华美生物工程有限公司);小量质粒快速抽提纯化试剂盒(上海博亚生物技术有限公司);DNA Marker,T4DNA连接酶，Eco RI等常规酶(上海Sangon公司)。

　　13   pESOD质粒提取及鉴定   用质粒快速抽提纯化试剂盒从含pESOD质粒的E.coli DH5α转化菌里提取pESOD质粒，取部分质粒用EcoRI酶切后琼脂糖电泳鉴定，另取部分质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。

　　14   定点突变

　　141   引物设计   根据hCu，Zn-SOD基因序列和定点突变的要求(将hCu，Zn-SOD中第111位Cys的密码子TGC突变为Ala密码子GCC)设计出一对包含突变位点的引物(正、反向)P1和P2,具体序列如下：P1：5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCGCAC 3′；P2：5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGAGAG 3′。下划线的碱基为突变位置。所有引物均由上海博亚生物技术有限公司合成。

　　142   PCR定点突变   整个反应体系为50μl，其中含无菌去离子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。

　　143   转化   用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物，直接转化感受态的E.coli DH5α，涂布培养后随机挑3个菌落并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限公司测序，测序引物P3：5′ACTCAGGTACTGGGAGTG 3′。

　　2   结果

　　21   提取的质粒经EcoRI酶切后琼脂糖电泳   质粒大小为3300bp左右，证明所提取的质粒就是pESOD质粒，见图1。

　　1：EcoRI酶切后的pESOD质粒;2：Marker

　　图1   pESOD质粒经EeoRI酶切后琼脂糖电泳（略）

　　22   PESOD质粒测序的部分结果   所测序列与文献