岩藻糖转移酶基因转导对人卵巢癌细胞信号通路(2)

　　4。5 SB203580 作用后RMG-I-H 细胞凋亡率、p38MAPK 和caspase-3 的变化4。5。1 细胞凋亡率增加用Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色(左下象限)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC 染色，碘化丙啶染色呈阴性(图右下象限)；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC 和碘化丙啶染色(图右上象限)。 图左上象限出现的是许可范围内的检测误差。每个样本计数1×104 个细胞，在SB203580 0。1 mM，1 mM 及10 mM 三个不同浓度作用下实验组细胞RMG-I-H 的凋亡率分别为(15。927±0。861) %、(18。187±0。481) %及(33。565±0。912) %，明显高于对照组和空白组(P均<0。05)，随着SB203580 作用浓度增加，细胞的凋亡率增加(P 均<0。05)，而对照组三组间及其和空白组间的凋亡率无明显差别(P 均>0。05) (FIG。4)。

　　4。5。2 p38MAPK 和caspase-3 基因的表达变化p38MAPK 特异性抑制剂SB203580 处理后，与空白组和对照组比较，实验组p38MAPK基因的表达逐渐减少(P 均<0。05) (FIG。5 A, C)，凋亡因子caspase-3 基因表达逐渐增多(P 均<0。05) (FIG。5 B, D)，而对照组三组间及其和空白组间无统计学差异(P 均>0。05) 。

　　4。5。3 p38MAPK、p-p38MAPK 和caspase-3 蛋白的表达变化p38MAPK特异性抑制剂SB203580 处理后，p38MAPK相对表达强度虽然没有显着差异，但其磷酸化形式p-p38MAPK 相对表达强度明显下降(P 均<0。05)，并随着SB203580 浓度增加逐渐减少(P 均<0。05)，而凋亡因子caspase-3 蛋白表达明显增高(P 均<0。05)，并随着SB203580 浓度增加逐渐增高(P 均<0。05) (FIG。5 E, F) 。对照组三组间及其和空白组间无差异性(P 均>0。05)。

　　4。6 卡铂和SB203580 作用后p38MAPK 基因表达的变化分别取指数生长期卵巢癌细胞系RMG-I 和RMG-I-H 细胞，实验分六个组：单加卡铂组(其终浓度为60 μg/ml)；加SB203580+卡铂组(加入SB203580 使其终浓度为10 mM，预孵育45 min，加入卡铂使其终浓度为60 μg/ml)；两细胞系分别另设阴性对照组，继续培养72 h，收集细胞。利用RT-PCR 法检测RMG-I 细胞与RMG-I-H 细胞的p38MAPK 基因的表达(FIG。6)，结果表明，两细胞系在卡铂作用下p38MAPK 相对表达强度明显高于相对的阴性对照组(P 均<0。05)；且转染后RMG-I-H 细胞p38MAPK 相对表达强度明显高于未转染的RMG-I细胞(P<0。05)；两细胞系SB203580+卡铂组p38MAPK 相对表达强度均明显低于相对的单用卡铂组(P 均<0。05)。两细胞系在卡铂作用下caspase-3 相对表达强度明显高于相对的阴性对照组(P 均<0。05)；且转染后RMG-I-H 细胞p38MAPK 相对表达强度明显低于未转染的RMG-I细胞(P<0。05)；两细胞系SB203580+卡铂组caspase-3 相对表达强度均明显高于相对的单用卡铂组(P 均<0。05)。

　　5 讨论恶性肿瘤耐药性的产生是极其复杂的多因素的过程，其发生机理尚不清楚，目前认为可能与进入细胞内的药物的外排增加、细胞内解毒物质的增多、药物靶位点的变异或药物损伤后的靶位点修复的增强、以及细胞凋亡的减弱等多种机制有关。我们在前期研究中发现细胞表面Lewis y 增加卵巢癌RMG-I 对卡铂、5-Fu 及紫杉醇的耐药，但是Lewis y 引起耐药的具体机理目前尚不清楚。

　　Lewis y 抗原是双岩藻糖基化的寡糖，属于A, B, O, Lewis 血型家族成员。 75%的上皮性卵巢癌出现Lewis y 不同程度的过量表达，且表达增加的患者预后不佳，我们利用基因转染的方法将人α1,2-FT 基因转入人卵巢癌细胞系RMG-I 建立Lewis y 抗原稳定高表达细胞系RMG-I-H，利用细胞免疫化学染色法检测RMG-I-H 和RMG-I 细胞膜上Lewis y 抗原的表达，结果显示RMG-I-H 的Lewis y 表达明显高于RMG-I[4]，并利用该细胞系进一步证明了Lewis y 抗原的表达与卵巢癌的恶性生物学行为有关。本实验通过RT-PCR 方法证明RMG-I细胞转染α1, 2-FT基因后FUT-1mRNA及Lewis y抗原水平显着增加的同时，caspase-3凋亡因子mRNA 和蛋白水平显着减少，另外，在前期的研究中我们用流式细胞仪也检测出转染后细胞RMG-I-H 的凋亡率减少，提示转染后Lewis y 抗原高表达的同时细胞凋亡减弱。

　　我们利用基因芯片的方法研究发现，α1, 2-FT 基因转染后的人卵巢癌细胞系RMG-I-H与转染前的细胞系RMG-I 相比，有88 种差异性表达基因，其中60 种基因表达增强，差异表达的基因参与了细胞增殖，信号转导，细胞黏附等多方面。我们还发现，α1, 2-FT 基因转染后的RMG-I-H 细胞的部分耐药蛋白在基因及蛋白水平表达明显增高(如MDR-1、MRP-1、MRP-2、PKC-α、TopoⅠ)，其变化与Lewis y 抗原表达密切相关，其中PKC-α 作为细胞传导通路中经典的蛋白激酶，可激活抗凋亡的信号传导通路进而参与多种肿瘤细胞的耐药。另外，H sieh 等[10]研究结果发现蛋白激酶C-α(protein kinase Calpha, PKC-α)低表达的细胞株细胞增殖能力、侵袭性均降低,且p38MAPK 磷酸化水平降低，经p38MAPK 抑制剂SB203580作用后的细胞株的增殖侵袭及转移能力也降低，提示p38MAPK 参与PKC-α 介导的肝癌细胞增殖和侵袭。因此我们推测，Lewis y抗原可能作为细胞表面信号传导系统的重要组成成分，参与细胞的耐药。

　　2004 年Klinger 等发现抗Lewis y 抗体能通过抑制EGFR 介导的信号转导通路MAPK 的磷酸化，促进肿瘤细胞的凋亡。p38MAPK 信号转导通路是MAPK 家族中的重要组成部分，其主要在一系列应激、凋亡和分化反应中起作用。目前已知一些促炎因子、应激刺激可激活p38MAPK，此外p38MAPK 还可被脂多糖及G+细菌细胞壁成份所激活。本实验通过RT-PCR，Western blot 法证实人卵巢癌RMG-I 细胞转染α1,2-FT 基因后p38MAPK mRNA 表达量明显增加。虽然转染前后细胞系p38MAPK 表达量没有明显的变化(P>0。05)，但是其磷酸化形式表达量却明显增加(P<0。05)。抗Lewis y 单克隆抗体可以阻断p38MAPK 的磷酸化，而且阻断效应随着时间的增加而加强(P<0。05)，说明Lewis y 抗原与p38MAPK 信号通路密切相关。p38MAPK 特异性抑制剂SB203580 作用后细胞凋亡明显增加，而凋亡因子caspase-3 在mRNA 和蛋白水平都随着抑制剂浓度的增加而显着增加，提示了卵巢癌RMG-I-H 细胞表面的Lewis y 抗原是通过激活p38MAPK 信号通路起到抑制凋亡的作用。

　　我们前期研究发现α1,2-FT基因转染后卵巢癌细胞RMG-I-H对卡铂的耐药性明显增强。

　　本实验利用卡铂和SB203580+卡铂作用于两细胞系，结果显示：两组细胞单用卡铂组p38MAPK 及caspase-3 相对表达强度均明显高于其相对的阴性对照组(P 均<0。05)，而转染后RMG-I-H细胞单用卡铂组p38MAPK 及caspase-3 相对表达强度均明显高于未转染RMG-I细胞单用卡铂组(P 均<0。05)，两细胞系SB203580+卡铂组p38MAPK 相对表达强度均明显低于相对的单用卡铂组(P 均<0。05)，同时caspase-3 相对表达强度均明显高于相对的单用卡铂组(P 均<0。05)，而两细胞系SB203580+卡铂组间p38MAPK 及caspase-3 相对表达强度没有明显的差异(P 均>0。05)，进一步说明提示细胞通过p38MAPK 途径抑制凋亡，参与细胞对卡铂的耐药。而Lewis y 作为EGFR 上的重要组成部分(结果未显示)，参与上述细胞的耐药。

　　关于p38MAPK信号通路与细胞凋亡的关系，目前并没有统一说法。本实验通过RT-PCR、Western blot 法和流式细胞检测证实卵巢癌RMG-I-H 细胞表面的Lewis y 抗原通过激活p38MAPK 信号通路起到抑制凋亡的作用，在p38MAPK 特异性抑制剂SB203580 作用后细胞凋亡明显增加，而凋亡因子caspase-3 在mRNA 和蛋白水平都随着抑制剂浓度的增加而显着增加。Flacke JP 等报道p38MAPK 和Akt 激酶的短暂激活导致凋亡细胞的数量、caspase-3分裂和Bcl-xL 过表达都显着的减少，这些作用能被Akt-或者p38-的磷酸化形式的阻碍而阻断。Tsuchiya 等报道在结肠癌DLD-1 和SW480 细胞系中，p38MAPK 的抑制剂FR167653能剂量依赖方式抑制细胞的增殖，增加细胞凋亡，同时激活caspase-3, 8, 9，这些说明p38MAPK 信号通路有抑制细胞凋亡的作用。 另外，还有研究表明p38MAPK 有诱导细胞凋亡的作用，Tikhomirov等认为，乳腺癌细胞中EGFR 和ErbB-2 的高表达可导致p38MAPK的持续激活，激活的p38MAPK 直接结合并磷酸化Bcl-2，进一步诱导下游caspases 的活化，引发细胞凋亡。LIU SI[14]等发现，邻乙汞硫基苯酸钠通过磷酸化p38MAPK 介导caspase-3 的活化，诱导SCM1 细胞Ca2 + 非依赖性凋亡。由此可见，虽然p38MAPK 在不同的细胞系中参与凋亡机制有所不同，这可能与细胞系的不同或者细胞周边环境的不同而引起，但值得关注的是p38MAPK 确实与肿瘤细胞凋亡密切相关，这有利于我们研究肿瘤耐药的机制，有助于我们探索对癌症治疗的新发现。

　　综上所述，本实验证实了细胞系RMG-I-H 表面的 Lewis y 抗原在通过p38MAPK 通路抑制凋亡、引起细胞耐药等方面起着重要的作用，我们认为Lewis y 抗原可能成为卵巢癌治疗及卵巢癌耐药机制研究的新靶点，将有利于改善临床卵巢癌的基因治疗和预后，其机制还有待于进一步的研究。 （科教论文网 lw.nSeAc.com编辑发布）