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骨髓间充质干细胞输注对重型再生障碍性贫血治(2)

2014-05-05 01:09 入DBA/2小鼠胸腺淋巴结细胞1×106/只。小鼠照射后立即移入中山大学动物实验中心SPF级无菌层流室内，饮用加有庆大霉素（40万U/L）和二性霉素B（50 MG/L）高压灭菌水，每日观察并记录小鼠体重、活动力、外表、饮食、大便、死亡情况，制模后28天实验终止。
　　MSC分离、扩增及输注

　　取正常儿童骨髓2 ML，按本室已建立的方法［7］进行MSC分离、扩增，传代至4-5代时收获细胞，于制模后第3天（照射后72小时）经小鼠尾静脉注射人源MSC 1×106。

　　实验分组

　　雌性BALB/C小鼠30只，分为3组：①再生障碍性贫血模型组：11只，照射+胸腺淋巴结细胞输注；②MSC组：10只，照射+胸腺淋巴结细胞输注+MSC输注；③单纯照射组： 9只，仅照射。

　　观察指标

　　生存率及生存曲线。 比较各组小鼠生存情况。

　　外周血象检测 于制模后第7、10、14、21天分别断尾，微量吸管采集肝素抗凝血20 ΜL，细胞计数仪检测白细胞（WBC）、血红蛋白（HB）、血小板（PLT）水平。

　　单侧股骨有核细胞数测定及骨髓造血祖细胞集落培养 于制模后28天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，在无菌条件下取出右侧股骨，用不含血清IMDM培养液冲洗细胞，离心，弃上清，加1 ML IMDM混匀，计单测股骨有核细胞数量。取2×104 细胞接种于1 ML甲基纤维素半固体培养基METHOCULTTM GFM3434（美国STEM CELL公司产品）中进行造血祖细胞集落培养，于第7天在倒置显微镜下计数粒簿奘上赴集落（CFU睪M）。

　　组织学检查 于制模后28天或濒死时颈椎脱臼处死实验小鼠，取小鼠肝、脾及左侧股骨，富尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色,显微镜下观察组织学变化。

　　统计学处理

　　用SPSS 11.5 软件处理资料，多组均数的比较采用ONE瞁AY睞NOVA, 绘制KAPLAN睲EIER生成函数曲线并对其进行LOG RANK检验。

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　　结 果

　　MSC对再生障碍性贫血小鼠存活率的影响

　　照射组于照射后2-3天、2周体重轻微下降，3周左右恢复正常，至28天时均存活。模型组于制模后3-7天体重明显下降，第9天略有回升，12天再次明显下降，苍白、活动明显减少，弓背，松毛，9只于12-19天死亡，解剖发现各脏器苍白，胸腺、脾脏、淋巴结萎缩，部分小鼠小肠有出血点，另2只于3周后体重回升，活动渐增多，毛光滑，模型组小鼠28天存活率为18.2%。MSC组体重变化与照射组相似，2只于16天死亡，其28天存活率为80%。各组KAPLAN睲EIER生存函数曲线如图1所示，MSC组与模型组生存曲线比较差别具有极显著意义（LOG RANK统计量=7.33，P=0.0068）。

　　MSC对外周血象的影响

　　结果见附表。如表所示，模型组小鼠于制模后7天WBC明显下降，与MSC组及照射组比较差异均具有显著意义（P<0.01）；10天时3组血象指标均显著降低；14天时模型组外周血象仍明显降低，而MSC组和照射组开始回升，至21天血象基本恢复正常。9只再生障碍性贫血模型鼠于3周内死亡，2只生存至21天时血象亦逐渐回升。