拟Smac作用下膀胱癌T24 细胞增殖及凋亡的研究

引言

Smac/DIABLO 蛋白（线粒体促凋亡蛋白）自被发现以来，经过几年的研究已经成为细胞凋亡研究中的一个热点。近年来，国内外很多学者将其应用于泌尿系统肿瘤研究和治疗，并认为Smac/DIABLO及由它衍生而来的小分子多肽及其类似物将为未来泌尿系统肿瘤的治疗开辟一个新领域[1]。纳米技术作为近年来出现的高技术新兴科学，由于其表现出现的各种特性，有利于医学及其各个分支的研究，特别是对肿瘤的早期诊断和治疗有着显着的意义。
　　本文将二者相互联系，通过合成的拟Smac 多肽磁性纳米粒作用于膀胱癌T24 细胞，探讨其对膀胱癌T24 细胞的增殖及凋亡的影响2. 材料与方法2.1 试剂拟 Smac 合成肽羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物（SmacN7-O-CMC-MNPS）由前期实验制备合成。MTT 溶液、Hoechst33258 染色试剂盒购自武汉凌飞生物公司。抗Bcl-2、Bax、β-actin单克隆抗体购自美国cellsignal 公司。RPMI1640 培养基及胎牛血清购自美国GIBCO 公司。
　　其他常用生化试剂购自美国Sigma 公司。
　　2.2 细胞培养与实验分组实验

设正常对照组（A）、单纯SmacN7-O-CMC-MNPS 组（B）和SmacN7-O-CMC-MNPS加磁场组（C）。膀胱癌T24 细胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640 培养基培养于5%CO2的37℃培养箱中，待细胞生长至对数期时用无血清1640 洗涤2 次，每孔滴加0.5μmol/L 的SmacN7-O-CMC-MNPS，C 组磁场为8mT。转染4h 后加入含胎牛血清的1640 培养基继续培养。
　　2.3 MTT 检测细胞增殖参照 MTT 试剂盒使用说明。

以细胞密度约104/孔接种于96 孔板，按照上述实验分组，每组设置4 个复孔，每孔100ul，按照不同分组加入药物，继续培养24h、48h、72h 后采用MTT 法检测细胞增殖活性，绘制细胞增殖率变化曲线，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖率=实验组A490nm/正常对照组A490nm×100%，（A 为吸光度值）细胞增殖抑制率=（1-细胞增殖率）×100%。

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按照上述实验方法处理24h 后，用0.25%胰酶+0.02%的EDTA 消化细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度约为107 /ml,取细胞悬液100ul，加5ul Hoechst33258 染液（100ug/ml）细胞悬液中，充分混匀后滴于载玻片上，盖片封片后在荧光显微镜下观察细胞形态并摄影。
　　2.5 实时荧光定量PCR（Realtime RT-PCR）检测

P53,Bax,Bcl-2 mRNA 的表达采用 TRIZOL 试剂两步法提取各实验组细胞的总RNA，运用逆转绿试剂盒合成cDNA.使用primer5.0 设计Bax、Bcl-2、β-actin 引物。反应体系20ul：cDNA 0.8ul、上游引物0.8 ul、下游引物0.8ul、SYBR Green Mix 10ul、DEPC H2O 7.6ul.扩增条件：94℃ 预变性5min，94℃ 30S， x℃(不同基因退火温度不同)15S, 72℃15S,共计40 个循环，72°延伸10min，每0.2℃读板一次，绘制扩增曲线及溶解曲线，收集数据。
　　2.6 蛋白免疫印迹（Western-Blot）检测

Bax,Bcl-2 蛋白的表达收集各实验组细胞，用BCA 试剂盒对蛋白样品定量。取等量蛋白20ug 上样于10%的SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），以120mV 恒压电泳1h，200mA 恒流转膜50min，膜于含5%脱脂奶粉的TBST20ml 封闭液室温封闭30min，加一抗(1:1000)4℃过夜，次日TBST 洗膜10min×3 次，加用封闭液稀释的HRP 标记的二抗（1：7500）室温1h，