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Cdh1小干扰RNA载体构建与鉴定探析

2014-06-15 01:11 毕业

【摘要】目的Cdh1是细胞周期后期分裂促进复合物APC的一个调节亚基，在细胞周期调控中发挥着重要作用。近年来研究发现，Cdh1-APC在哺乳动物神经元中有大量表达，具有调节轴突生长和突触形成的功能，其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用。为了进一步探讨Cdh1的功能，本实验拟构建Cdh1小干扰RNA载体，并将其转染至Hela细胞进行鉴定。方法 根据pENTRTM/H1/TO载体要求和参考文献设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体，形成完整载体，经转化单菌落扩增培养后进行测序鉴定。分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞，转染后48 h分别提取转染两组载体及未转染细胞总RNA，逆转录成cDNA，以逆转录产物为模板，β-actin基因为内参照进行实时定量PCR反应，共反应40个循环后，分析融解曲线，以△Ct表示Cdh1的表达，△Ct=CtCdh1）- Ct（β-actin ），△Ct值越高，Cdh1的表达越低；同样，转染后48 h分别提取三组细胞总蛋白，以β-actin为内参照，进行Western blot检测Cdh1的表达。结果 经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体，无碱基突变，分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol。实时定量PCR反应融解曲线分析表明设计的引物均得到了特异性的产物，与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞△Ct值明显升高，差异具有统计学意义，P<0.05，说明Cdh1表达降低。而未转染组与转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，△Ct值无显著性差异（见表1）。采用Western blot检测Cdh1蛋白的表达，图片分析显示转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1蛋白表达水平明显低于其他两组（见图2）。结论 成功构建Cdh1小干扰RNA载体，通过检测具有基因下调作用，为进一步研究Cdh1-APC在中枢神经系统中的作用奠定了基础。

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表1 实时定量PCR检测Hela细胞中Cdh1的表达（  ±s）
类别 Ct(β-actin ) Ct(Cdh1) △Ct
未转染 26.66±0.01 30.93±0.01 4.27±0.01
转染pENTR/shcontrol 27.08±0.22 30.92±0.39 3.84±0.61
转染pENTR/shcdh1 26.40±0.70 35.72±0.21 9.32±0.91a
aP<0.05 vs未转染及转染pENTR/shcontrol相比