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作者：田超 周总光 孟文建 李立 于永杨 杨烈 雒洪志 周宾
【摘要】 目的 定量检测Wnt1诱导分泌蛋白1(Wnt1 induced secreted protein1，WISP1)基因在人直肠癌及远端正常直肠组织中的表达，为进1步研究该基因功能提供线索。方法 提取人直肠癌及癌旁正常直肠组织总RNA，采用实时RT睵CR分析WISP1的表达，再对PCR结果进行分析。结果 WISP1 mRNA在直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常直肠组织，差异有统计学意义(P<0.05)。WISP1的表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移等因素有相关性。结论 WISP1基因的异常表达可能与直肠癌的发生、发展有关，有望成为直肠癌诊断预后的标志物和治疗的新靶点。
【关键词】 Wnt1诱导分泌蛋白1基因； 直肠肿瘤； mRNA
Expression of Wnt1 induced secreted protein1 in rectal cancer and its clinical significance
【Abstract】 Objective To provide basis for further study of Wnt1 induced secreted protein1 (WISP1) gene by quantitatively detecting its expression in rectal cancer tissues and distal normal rectal tissues. Methods Real瞭ime RT睵CR was used to detect the expression of WISP1 mRNA in 86 samples of rectal cancer tissues and distal normal rectal tissues. Results The average level of WISP1 mRNA expression in rectal cancer tissues was 7.744 times than that in normal rectal tissues, with statistical significance (P<0.05). The level of WISP1 mRNA expression was correlated with tumor differentiation, Dukes stage and lymph node metastasis. ConclusionsThe abnormal expression of WISP1 gene may play an important role in the carcinogenesis and development of rectal cancer. WISP1 may be helpful for prognostic evaluation and gene therapy in rectal cancer.
【Key words】 Wnt1 induced secreted protein1 gene; Rectal caner; mRNA
结直肠癌的发生、发展是多基因，多事件积累的结果。通过多年来的研究发现Wnt1信号传导途径异常激活参与了人类结直肠癌的发生［1］。Pennica等［2］研究表明Wnt1诱导分泌蛋白1(Wnt1 induced secreted protein1，WISP1)是Wnt1信号通路的下游靶基因之1。本实验采用实时RT睵CR方法检测直肠癌中WISP1 mRNA的表达，为深入研究WISP1基因与直肠癌的发生、发展提供线索。
1 材料与方法
1.1 标本取材
收集4川大学华西医院普外科2003-2004年确诊的86例直肠癌患者资料，其中男44例，女42例。各病例分别取直肠癌组织以及相邻远端正常直肠黏膜组织。组织在离体30 min内取材， 并于液氮速冻置于-70 ℃冰箱保存备用。所取标本均经病理检查证实。
1.2 主要试剂
逆转录酶M睲LV为Takara公司产品； Trizol试剂为Gibco公司产品； DEPC、 DNaseⅠ、 RNase为Sigma公司产品；引物和探针由Takara公司合成。
1.3 总RNA提取及逆转录反应
按RNA抽提步骤用Trizol抽提组织中总RNA，紫外分光光度法测定260 nm和280 nm的吸光度(A值)， 甲醛变性凝胶电泳观察其完整性， 只有A260/A280在1.8～2.0，28S/18S在2左右的样本才进入下1步的实验。用逆转录酶M睲LV将RNA逆转录成cDNA。
1.4 实时RT睵CR反应
以Primer Express TM 1.0软件设计引物及探针序列。目的基因WISP1上游引物5′睠CACCGGG睪CCTCTACT3′，下游引物5′睠CACACCGACCACC睺GT3′，探针5′睩AM睠TATTGCGTACCTCGGGCGGTC睺AMRA3′。内参照GAPDH上游引物5′睠CTCAAGATCATCAGCAAT3′，下游引物，5′睠CATCCACAGTCTTCTGGGT3′，探针5′睩AM睞CCACAGTCC睞TGCCATCAC睺AMRA3′。RT睵CR条件：降解程序95 ℃5 min；扩增和定量程序95 ℃20 s，60.5 ℃30 s，72 ℃30 s；循环50次。
1.5 扩增效率及产物分析
取目的基因WISP1与管家基因GAPDH按1∶1、1∶5、1∶25、1∶125、1∶625稀释成5等份，进行PCR扩增。利用RESTh软件对扩增结果分析，分别计算WISP1和GAPDH扩增效率及线性关系。RT睵CR以CT为标准，根据文献［3］方法计算比值R。R＞1表示直肠肿瘤组织中WISP1基因表达上调。
1.6 统计学分析
用相对表达软件工具瞂L［4］对RT睵CR结果进行分析，揭示直肠癌组织及正常直肠组织两组间WISP1的表达是否有差异。利用SPSS 11.0软件包中Chi布煅楹椭群图煅榉治鯳ISP1与临床病理指标之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总RNA电泳检测及定量
电泳结果表明，提取的总RNA呈现清晰的18S与28S RNA条带，两者比例约为2∶1，表明具有良好的完整性。根据260 nm波长的光吸收值A260计算RNA的含量。A260/A280比值均>1.8，表明纯度符合要求。
2.2 RT睵CR扩增效率和线性关系
GAPDH及WISP1扩增效率分别是1.61及1.85。线性关系为r=1。
2.3 WISP1基因在直肠组织中的表达
86例直肠癌样本中有56例过度表达，其中有17例直肠癌中的表达是正常直肠组织的1～5倍，有5例是6～10倍，有34例是超过10倍。RESTh结果显示在直肠癌中WISP1的平均表达水平是正常直肠组织的7.744倍，两组表达量的差别有统计学意义(P<0.05)，说明WISP1基因在直肠癌中的表达上调。
2.4 WISP1基因水平与临床病理指标的关系
它与直肠癌的分化程度、Dukes分期及淋巴结转移有关，与年龄、性别及CEA等临床病理因素无明显相关性(表1)。表1 86例直肠癌患者Wnt1诱导分泌蛋白1表达水平与临床病理资料的关系（略）
3 讨论
结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤之1，其发病率近年呈明显的上升趋势，发生机制至今仍不很清楚。Pennica等［2］研究表明WISP1作为Wnt1信号通路下游基因在结肠癌组织中过度表达，对结肠肿瘤的形成发挥重要作用。
本实验采用实时RT睵CR检测WISP1的表达，其中56例患者表达上调，且在直肠癌中WISP1的平均表达水平显著高于周围正常的直肠组织。这提示该基因可能与直肠癌的发生、发展有关。WISP1表达水平与患者的分化程度、Dukes分期、淋巴结转移有显著相关性。随着分化程度的降低WISP1表达量逐渐升高。Dukes C、D期明显高于A、B期，差异有统计学意义。肿瘤恶性程度越高，WISP1表达率越高，发生直肠壁浸润、直肠壁淋巴结浸润和直肠周围淋巴结转移及腹腔转移的几率越高，提示直肠癌活检组织WISP1表达可作为临床判断大肠癌的恶性程度及预后的1项监测指标。在有淋巴结转移病例中WISP1表达阳性率(82.9%)显著高于无淋巴结无转移病例(52.9%)，它参与了直肠癌淋巴结转移，可作为1个新的预测结直肠癌转移潜能的生物学指标。内镜在诊断直肠癌同时检测WISP1表达，对诊断和术前预测直肠癌淋巴结,组织器官转移和直肠癌患者预后有意义。
【参考文献】
（科教论文网 lw.NsEac.com编辑整理）