论视神经离断对神经干细胞定向诱导分化的影响(2)
2017-09-09 04:16
导读：假手术组和视神经离断组大鼠在术后5d断头处死，取手术对侧的上丘组织，正常对照组随机取单侧上丘组织。上丘组织培养采用我们已经建立的方法。 1.
假手术组和视神经离断组大鼠在术后5d断头处死，取手术对侧的上丘组织，正常对照组随机取单侧上丘组织。上丘组织培养采用我们已经建立的方法。
1.6双室组织一细胞共培养系统
该系统由上下两室组成。上室为透明PET微孔(孔径0.4μm)滤膜培养小室(Becton Dickinson产品)，下室为配套的24孔培养板，可将上室悬吊起来。共培养时将上下室组合起来。
1.7神经干细胞的自然分化
取传4代的NSCS悬液，从500r／min离心5min，弃上清，加入干细胞分化培养液(Neurobasal培养液+B27(1：50)+10％FBS+谷氨酰胺4 mmol／L)轻柔吹打。调整细胞密度为1×105／ml后将1 ml悬液滴入下室，上室中不放组织块，仅加入分化培养液。把接种后的双室组织一细胞共培养系统放人C02培养箱中于37℃ 、5％CO2条件下贴壁培养。隔日用相差显微镜观察细胞生长分化情况，贴壁培养14d后进行荧光免疫细胞
化学染色。1.8上丘组织一神经干细胞共培养诱导分化
将传4代的NSCS悬液以500r／min离心5min，弃上清，加入分化培养液轻柔吹打，调整细胞密度为1×105／ml后取1ml悬液滴入下室中于37℃ 5％C02条件下贴壁培养。3d后将已在体外培养4d的上丘组织移入共培养系统进行共培养。6d后将上室移去，神经干细胞继续培养至14d。
1.8分化细胞的鉴定
细胞免疫荧光染色步骤同前，根据需要上不同的一抗，抗体工作浓度分别为：MAP-2(1:50)、GFAP(1:100)、Thyl.1(1:100)。根据不同的一抗选择FITC或Cy3荧光二抗。阴性对照使用PBS液代替一抗。对Thyl.1阳性的培养孔，每孔随机选择3个克隆，在细胞疏松区域选择4个不同视野，记数总细胞数和Thyl.1阳性细胞数，计算阳性率。
（转载自http://zw.nseac.coM科教作文网）
2 结果
2.1 上丘神经干细胞克隆形成及鉴定
大鼠胚胎上丘细胞接种48h后培养液明显黄变，大部分细胞死亡，存活的部分细胞胞体增大，折光性增强，伴有明显光晕。部分细胞出现分裂相，细胞可成对出现。随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，呈球形悬浮生长，边缘细胞折光性较强。对第2代细胞进行单细胞克隆培养后发现，细胞可形成亚克隆，这些来自单个细胞的亚克隆可以进行传代培养，并大量增殖。
使用激光共聚焦显微镜，进行三维重建后可以清晰地看到克隆球呈Nestin阳性，中心的细胞较为
2.2分化细胞的鉴定
