脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定(2)

　　分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，接种24孔板，每孔1×104个细胞/mL。胰酶消化并计数，每天计数3孔，绘制细胞的生长曲线。

　　1.4 细胞活性检测

　　分别取第1、5、9代细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞浓度至1×104个细胞/mL，每孔100 μL接种于96孔板，在37 ℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱内培养2天。向每孔加MTT溶液(5 mg/mL用PBS，pH=7.4配制)10 μL。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μLDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS 12.0统计学软件处理，结果以均数±标准差表示，采用配对t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学观察

　　原代细胞接种5 d后首次换液，细胞呈圆形或短梭形(图1A)。9 d后细胞进入增殖期，形成细胞集落，细胞形态也逐渐向长梭形改变。2周后基本达到70%融合状态(图1B)，传代培养。传代后细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态，4～5 d后可达80%融合。

　　2.2 细胞表面抗原分析

　　不同代次UCB-MSCs表面抗原检测结果见表1。第1、5、9代细胞的CD29和CD44均呈较高表达，阳性率在50%～70%左右。CD34和CD45则呈低表达，阳性率不超过5%。表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的阳性表达率

　　2.3 细胞倍增时间分析

　　细胞传代培养的潜伏期约为36～48 h，第3天开始，数量逐渐增多，对数增殖期约为4～7 d，随后细胞逐渐减少(图2)。根据生长直方图可知，UCB-MSCs的群体倍增时间为(47.5±9.32)h。从第9代开始细胞倍增时间逐渐延长达(71.6±6.28)h，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.4 细胞活性检测