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脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定(3)

2014-05-10 01:02

　　为了检测长期培养后的细胞活力，本实验用MTT法检测培养的1、5、9代细胞活力。结果显示培养的UCB-MSCs的生长状态良好，在细胞活力方面1～5代细胞无明显的差异(P>0.05)，但在第9代细胞的增殖活力稍下降，但差异不明显(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 具有多向分化潜能，是组织工程研究中较为理想的种子细胞，是研究人工组织工程材料的必备条件。安全、充足并不受伦理学制约的间充质干细胞来源是组织工程研究中要解决的问题。以往的文献报道和研究证实,骨髓作为MSCs的来源已经得到证实，并针对骨髓源性的MSCs进行了一积极的探索[4-6]。但随着年龄的增加，骨髓中MSCs的含量明显减少[1]1847-1861，且受病毒感染机会显著增加，获得骨髓的过程也会造成一定的二次损伤，这些均限制了骨髓源性的MSCs的应用，寻找替代的间充质干细胞来源成为研究者关注的热点。有人认为脐血也有含有MSCs，但随胚胎成就程度的不同MSCs的含量各不相同。但脐血是否存在MSCs，并作为MSCs供源一直有争议[7]。支持者认为脐血与骨髓相比较，具有更充足的来源，且免疫原性低，能耐受更大程度HLA配型不符，分离出的MSCs纯度更高[8] 。虽然脐血MSCs占脐血单个核细胞(mononuclear, MNC)的比例较小，仅有约25%的脐血样本的MNC含有并经培养后出现MSCs，但脐血MSCs有85%以上处于细胞周期的G0/G期[9]。因此，从脐血中成功分离扩增出MSCs，将作为一种新的MSCs的来源应用于科研和临床。

　　本实验采取密度梯度离心与直接贴壁法相结合，先用密度为1.073 g/L的淋巴细胞分离液对脐带血进行密度梯度离心，收获的中间层细胞中含有较多的单个核细胞;再经反复贴壁培养和除去悬浮生长细胞，得到较多呈融合状态的贴壁细胞。经MTT实验说明培养细胞有9代以前均具有良好的增殖能力，9代后稍下降。细胞的表面抗原检测发现细胞高表达CD29和CD44，但低表达C34和CD45，这与文献报道的一致[10]。一般认为，贴壁细胞中呈现成纤维细胞样形态， 具有旺盛的分裂增殖能力，且同时表达CD29、CD44，可以初步判断为是MSCs[3]。本研究经分离纯化获得均一生长的长梭形或多角形贴壁细胞，经过反复传代后贴壁细胞形态趋于均一，且细胞表型更为纯化，50～70%的细胞表达CD29、CD44，表明能从脐血中成功分离出UCB-MSCs。本实验在证明了脐血中含有MSCs的同时，成功的对UCB- MSCs进行了扩增，进行了初步的鉴定和生物学特征的检测，为MSCs进一步研究奠定了基础。

【参考文献】

       [1] Au A,Boehm CA,Mayes AM,et al. Formation of osteogenic colonies on well-defined adhesion peptides by freshly isolated human marrow cells[J].Biomaterials,2007,28:1847-1861.