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毛细管电泳吡啶钌电化学发光检测天仙子中生物(2)

2015-01-14 01:29
分离缓冲溶液的pH值不仅影响着待分析物所带电荷量还影响着毛细管内的电渗流。本实验通过改变缓冲溶液pH值来考察对两种样品分离的影响，当缓冲溶液pH值在4.06到6.08之间，阿托品和东莨菪碱ECL两峰重叠。尽管阿托品和东莨菪碱的pKa值相差无几[20.21]，但随着缓冲溶液pH值的增加，部分质子化的东莨菪碱迁移行为发生显著改变，两种生物碱的迁移时间间距加大，样品开始部分分离，当缓冲溶液为pH 8.48时分离度最高。但是继续增
大碱度它们的分离度反而减小（见图2），可能是由于二者在偏碱性缓冲溶液中荷质比类似具有相近的迁移行为所致。阿托品和东莨菪碱的分离度按下式计算：Rs=2(t2-t1)/(Wb1+Wb2)，式中：t1、t2分别为代表两种生物碱的迁移时间，Wb1、Wb2则代表测得两种生物碱的基线峰宽。
 

图2 缓冲溶液pH 对分离度的影响Fig. 2 Effect of buffer pH value on resolution样品（sample）：10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压(detection voltage)1.2 V；电动进样(electrokinetic injection) 7 s×10 kV；分离缓冲溶液(separation buffer): 20 mmol/L 磷酸盐；分离电压(separation
 
voltage) 15 kV。
3.1.3 检测池缓冲溶液pH 值的影响
在吡啶钌与生物碱ECL 共反应中，生物碱首先脱去质子，进而氧化形成还原态自由基中间体。该自由基中间体继续脱去质子，与三价吡啶钌发生共反应从而放出光子。由此可见溶液的pH 环境对于ECL 共反应有重要的影响。
缓冲溶液pH 值对两种生物碱ECL 的影响见图3。随着pH 值的增大，阿托品和东莨菪碱的发光强度增高呈现出先增长后下降趋势，在pH 7.48 和pH 6.03 处，阿托品和东莨菪碱分别取得最高ECL 强度。但是随着pH 增大阿托品和东莨菪碱分离度逐渐增大。考虑缓冲溶液pH 值对两种生物碱分离和检测的综合影响，本实验将池中缓冲溶液pH 定为7.48。 （转载自科教范文网http://fw.nseac.com）
 

图3 池中缓冲溶液pH 对ECL 强度和分离度的影响Fig. 3 Effect of buffer pH value on resolution and ECLa: 阿托品ECL 强度；b：东莨菪碱ECL 强度；c：分离度（resolution）sample: 10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压(detection voltage) 1.2 V； 电动进样（electrokinetic injection）7 s×10 kV；分离缓冲溶液(separation buffer) 20 mmol/L；分离电压15 kV。
3.1.4 进样电压和进样时间的影响
电动进样模式中进样量受进样时间和进样电压双重因素的影响。通常进样时间越长，进样电压越高，就会有更多的样品导入毛细管，到达电极表面，产生高的ECL 强度。但如果样品过载也会引起样品区带展宽，分离效率降低，分离度下降。如果缩短进样时间或者降低进样电压，虽然可以得到较高的柱效，但却很难获得满意的ECL 强度。职称论文
首先固定进样时间在7s，改变进样电压2 kV～16 kV，阿托品和东莨菪碱ECL 强度和分离度的变化趋势如图4 所示。另一方面改变进样时间，随着进样时间的增加，两种待测成分的ECL 强度和分离度也呈相同变化趋势，见图5。折衷考虑进样量对检测灵敏度和分离度双重影响，将电动进样条件12 kV×9 s 应用于后续试验中。
 
图4 进样电压对阿托品(a)和东莨菪碱(b)ECL 强度及分离度(c)的影响Fig. 4 Effect of injection voltage on resolution (c) and ECL intensity of atropine (a) and scopolamine (b)样品(sample)：10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压（detection voltage）1.2 V；进样时间(injection time)7 s；分离缓冲溶液(separation buffer) 20 mmol/L；分离电压(separation voltage)15 kV。
 
图5 进样时间对阿托品(d)和东莨菪碱(e)ECL 强度及分离度(f)的影响Fig. 5 Effect of injection time on resolution (f) and ECL intensity of atropine (d) and scopolamine (e)样品（sample）：10-5 mol/L 阿托品和10-4 mol/L 东莨菪碱； 检测电压（detection voltage）1.2 V；进样电压

DOI: 10.3724/SP.J.1096.2010.00915
2010, 38(6):915
（injection voltage） 12 kV；分离缓冲溶液（separation buffer）20 mmol/L；分离电压(separation voltage)15 kV。
3.2 线性范围、精密度和检测限
在所选择的最优条件下, 阿托品和东莨菪碱分别在0.29 mg/L -5.8 mg/L、3.0 mg/L -303mg/L范围内,浓度与峰高呈良好线性关系。在优化的条件下分别以阿托品（10-5 mol/L）和东莨菪碱(10-4mol/L)标准溶液连续6次进样，测定ECL峰高以及样品迁移时间，二种生物碱峰高与迁移时间的RSD见表一。阿托品和东莨菪碱的检测限分为0.014 mg/L，0.03 mg/L（S/N=3）。与其它传统的分析方法相比较，该方法具有灵敏度高、选择性好，操作简便，
快速分析的优越性能。文献报道几个方法与现有方法的比较见表二。

  3.3 中药天仙子的测定
在最佳分析条件下，取中药天仙子提取液进行适当稀释，应用本方法测定天仙子中二种主要活性成分阿托品和东莨菪碱，典型电泳谱图见图6。与加标电泳谱图相比较，可以定性鉴别阿托品和东莨菪碱。采用标准加入法，获得天仙子中生物碱的含量为：阿托品0.035% 东莨菪碱0 . 051%。同时做加标回收实验，阿托品和东莨菪碱的样品回收率分别为：96.21%、97.04%。

 图6 中药天仙子稀释萃取液的电泳谱图Fig. 6 Electropherogram of the diluted extract(1) 阿托品的 ECL 强度；(3) 东莨菪碱的ECL 强度；(2) 提取液中未知成分的电泳峰电动进样（injection）12 kV×9 s；其它条件同图5。
4 结论