高效液相色谱法测定乌梅中柠檬酸的含量
2015-06-01 01:11
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【摘要】 目的 采用高效液相色谱法测定中药乌梅中柠檬酸的含量。方法 选用Hypersil ODS柱（4.6mm×200mm，5μm），流动相为0.025mol/L Na2HPO4溶液（pH=2.5），流速为0.7ml/min，柱温为25℃，检测波长为214nm，外标法定量。结果 柠檬酸线性范围为3.0～9.0μg，r=0.9998，平均回收率为99.86%（RSD=2.0）。结论 该方法简便、准确、稳定、可靠，可用于乌梅的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法；乌梅；柠檬酸
Determination of citric acid content in fructus mume by HPLC
【Abstract】 Objective To determine the content of citric acid content in Fructus Mume by HPLC.Methods A Hypersil ODS column(4.6mm×200mm，5μm) was used as stationary phase and 0.025mol/L Na2HPO4(pH=2.5) was used as mobil phase with 214nm for detection wavelength.The flow rate was 0.7ml/min and the column temperature was 25℃.The quantitative analysis used external standard method.Results The linear range of citric acid was 3.0～9.0μg(r=0.9998).The average recovery was 99.86%(RSD=2.0).Conclusion The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be applied to quality control of Fructus Mume.
【Key words】 HPLC;fructus mume;citric acid
乌梅（Fructus Mume）为蔷薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sibe.Et Zucc.的干燥近成熟果实，酸、涩，平，归肝、脾、肺、大肠经，具有敛肺，涩肠，生津，安蛔之功效［1］。用于肺虚久咳，久痢滑肠，虚热消渴，蛔厥呕吐腹痛，胆道蛔虫等症。果实含有机酸（如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等），萜类，甾醇，氨基酸，糖类，挥发性成分，黄酮类，生物碱，微量元素（Fe、Mg、Cu等）［2］。《中国药典》2005年版采用电位滴定法测定乌梅中总有机酸的含量，本文采用HPLC法测定乌梅中柠檬酸的含量，为中药乌梅及含乌梅的中药制剂的含量测定提供依据。
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1 仪器与试剂
1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪：Waters 515泵、Waters 2487双波长检测器，Empower 2色谱工作站，DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，BS224S型万分之一电子天平，回流装置等。
1.2 药品与试剂 柠檬酸（AR，含一分子结晶水）；乌梅：产地峨眉，经本院中药鉴定教研室宋良科副教授鉴定，符合中国药典要求；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS柱（200mm×4.6mm，5μm）；柱温为25℃；流动相为0.025mol/L Na2HPO4溶液（pH=2.5）；流速0.7ml/min；检测波长214nm；进样量20μl。
2.2 溶液的配制
2.2.1 柠檬酸对照品溶液的配制 精密称取柠檬酸（AR）适量，加水溶解，制成0.5mg/ml的柠檬酸对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 分别取乌梅粗粉约4g，精密称定，置锥形瓶中，精密加水100ml，称定重量，加热回流4h，放冷，补足重量，滤过，收集续滤液。精密量取续滤液1ml于25ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2.3 标准曲线 分别精密量取0.5mg/ml柠檬酸对照品溶液3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，即得7个不同浓度的对照品溶液。分别进样各20μl，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果，柠檬酸在3～9μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=4376.107+1824436X，r=0.9998。
2.4 精密度试验 精密量取0.5mg/ml柠檬酸对照品溶液6.0ml，加水定容至10ml，连续进样5次（进样量20μl），结果见表1、图1，其峰面积的RSD=0.1%（n=5）。表1 精密度试验结果图1 柠檬酸对照品HPLC图（略）
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2.5 供试品溶液的测定 取乌梅药材约4g，精密称定，按2.2.2法制备，分别测定其柠檬酸含量。结果见表2、图2，RSD=1.36%（n=6）。表2 乌梅中柠檬酸含量测定结果 图2 乌梅HPLC图（略）
2.6 稳定性试验 精密吸取按2.2.2制备的供试品溶液20μl，每隔2h进样2次，测定其峰面积，取其平均值，结果样品峰面积在10h内稳定；RSD%=0.25%（n=6）。
2.7 回收率试验 取已知含量的乌梅药材各2g，精密称定，精密加入50.06mg/ml柠檬酸溶液10.0ml、10.0ml、7.5ml、7.5ml、5.0ml、5.0ml；按供试品溶液测定项测定，结果见表3。柠檬酸平均回收率为99.86%，RSD=2.0（n=6）。表3 乌梅中柠檬酸含量测定结果
3 讨论
3.1 《中国药典》2005年版采用电位滴定法测定乌梅中总有机酸的含量 据报道，有人曾在乌梅中分离出近10种有机酸：苹果酸、柠檬酸、草酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、焦精谷氨酸、甲酸、乙酸、丙酸。其中最主要的是苹果酸和柠檬酸，且随果实的不断成熟，二者含量会有所变化，早期的苹果酸含量大于柠檬酸，后期则是柠檬酸含量大于苹果酸。此外，乌梅药材中还含有绿原酸、延胡索酸、酒石酸等有机酸［3］。因此，测定乌梅中柠檬酸的含量比测定总有机酸的含量对乌梅质量更具可控性。
3.2 实验所用柠檬酸为分析纯，含有一分子结晶水 一水柠檬酸容易失去结晶水，为确保所柄制的对照品溶液的浓度准确，采用了0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定柠檬酸的含量，再进行准确配制柠檬酸对照品溶液。
3.3 最大吸收波长 柠檬酸的最大吸收波长为190nm，经实验验证在214nm处吸收较好，峰形稳定，而在其他波长处测定时效果较差。
3.4 柠檬酸为含有羧基和邻二酚羟基的极性有机酸 本实验选用0.025mol/L的Na2HPO4溶液为流动相，将其pH调为2.5后，柠檬酸在酸性环境下能较好的游离出来，与其他物质能很好地分离，出峰效果好。
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【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2005年版一部.北京：
化学工业出版社，2005，124.
2 刘友平，陈鸿平，万德光，等.乌梅的研究进展.中药材，2004，27（6）：459-461.
3 耿家玲，孟芹，付敏.乌梅的化学成分研究进展.云南中医中药杂志，2005，26（6）：43-44.
