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胞嘧啶脱氨酶基因治疗消化道肿瘤研究进展

2013-05-26 01:12

　　摘要:　胞嘧啶脱氨酶基因导入肿瘤细胞可将无毒性的原在肿瘤细胞内代谢为具细胞毒的产物而发挥抗肿瘤效应。本文综述了该基因的克隆、作用机制和在消化道肿瘤治疗中的研究进展。

　　随着分子生物学的迅猛发展，基因治疗这一崭新方法尽管还多处于实验研究手段，却已显示出良好的应用前景[1]。自1991年Huber等[2]提出病毒导向的酶解原药疗法（virus directed enzyme prodrug therapy,VDEPT）以来，有关的基因研究成为热门课题。目前，一个新的基因治疗系统——EC-CD/5-FC（大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶）系统正日益受到高度关注[3]。本文就胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）基因治疗消化道肿瘤的现状作一综述。

　　CD基因的克隆

　　胞嘧啶脱氨酶是大肠杆菌代谢旁路中的一种酶，哺乳动物细胞中不含该酶。Austin等[4]于1992年首先从大肠杆菌株中采用传统方法提取质粒DNA，进一步分离、纯化并转染宿主菌，初步构建成原核细胞中表达的CD质粒载体，克隆了编码CD的大肠杆菌基因，利用阳性基因筛选方法，获得一携带10.8 kb的DNA插入质粒，其中一3 kb的DNA片段保留有CD酶活性。CK蛋白质分子量为52000,DNA序列分析显示一含427个氨基酸开放读码框架编码CD。

　　为证实CD基因在真核细胞中表达以发挥作用，研究者采用寡核苷酸突变（oligonucleotide site-directed mutagenesis） 技术，将CD基因起始密码子由GTG→ATG，从而产生一5’起始密码子，选择pRc/CMV真核表达载体，构建成真核表达质粒pCMV/CD-1。以脂质体法将pCMV/CD-1导入人结肠癌WiDr细胞系，生长抑制试验显示转染后的结肠癌细胞对5-FC的IC50（半数抑制浓度）为30μmol,而未转染的结肠癌细胞其IC50为17000μmol，表明转染有CD基因的结肠癌细胞对5-FC的敏感性提高了近560倍[5]。

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　　CD基因转移方法

　　安全有效的基因转移方法是基因治疗的关键因素之一。至今，作为基因转移的载体，以病毒性载体介导的方法研究最为系统深入，几乎应用于所有的靶系统。在消化道肿瘤的CD基因治疗中，既往的研究仍选择逆转录病毒（retrovirus,RV）载体，这与对其基因组结构和生活周期了解得较清楚有关。RV载体大多由Moloney小鼠白血病病毒构建而成，为RNA病毒，基因组编码在一条单链RNA分子上，进入细胞后，逆转录成双链DNA，此DNA进入细胞核整合在受体细胞DNA上，并以此为模板合成病毒基因和后代RNA。采用RV转导CD基因，将CD基因整合于病毒长末端重复（LTR）的最末端，因而整合后的病毒基因结构可受到保护不致受损[6-8]。

　　目前转导CD基因多选择腺病毒(adenovirus,Ad)载体[9，10]。由于腺病毒为一双链DNA病毒，宿主范围广泛，尤其能有效地感染非分裂状态的细胞，另外，它不能整合到宿主细胞染色体上，因而较逆转录病毒更为安全。重组腺病毒载体主要来自于2型和5型腺病毒，容量大，可装载达7.6 kb。已有学者选用Ad载体介导CD基因转染入结肠癌HT29细胞系，将携带有大肠杆菌标记基因（Lac z） 的腺病毒注射到肿瘤组织中底物X-gal染色来判断基因转染效率。结果显示外源基因经单次注入后近5%-30%的肿瘤组织表达Lac z基因[11]。

　　作用机制

　　由于哺乳动物细胞中不存在CD，因而不能将胞嘧啶转化成尿嘧啶，更不能将5-氟胞嘧啶（5-Fluorocytosine,5-FC）转化成5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）。但通过基因转移技术将CD基因转入哺乳动物细胞，则哺乳动物细胞可将一些原来无毒性的原药（5-FC）转化为有细胞毒性的代谢产物（5-FU），导致细胞自杀性死亡。5-FC在高度抗微生物活性的浓度下对哺乳动物无毒性作用，经CD脱氨为5-FU，后者则具有高度细胞毒性，为广泛使用的抗肿瘤化疗药物[5，8，11]。

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　　CD基因作用的一个十分突出特点即所谓的“旁观者效应”（bystander effect），这与某些自杀基因的作用机制相似[12]。Hirschowitz等[11]最早观察到CD基因治疗结肠癌时的这一效应，当CD+的结肠癌细胞与CD-的结肠癌细胞混合时，比较了CD+的细胞比例为10%和100%时两者的细胞生长抑制水平，结果无显著性差异。对旁观者效应尚缺乏确切的解释，但大多同意“缝隙连接（gap junction）”引起旁观者效应，通过细胞间的接触，毒性代谢产物由“缝隙连接”从CD+的细胞转入CD-的细胞，从而使得后者变得原药也敏感了，并被原药代谢产物杀死[13]。但亦有学者提出不同意见，Trinh等通过电镜发现在肿瘤组织邻近区域有大量的“桥粒（desmosome）”存在，因其起着封闭细胞间转运的作用，推测旁观者效应并非上述机制，尚有其它机制参与，如细胞凋亡、原药代谢产物本身可穿过细胞膜等可能机制[14，15]。

　　几种消化道肿瘤CD基因治疗现状

　　结肠癌　 CD基因治疗的研究对象以结肠癌为多。Huber等[16]观察到裸鼠5-FC的半衰肠期大约是40分钟，腹腔内给予500 mg/(kg·d)的5-FC，其血浆水平可维持在4 000μmol。体外试验显示：对于CD+结肠癌细胞，5-FC的IC50仅为5μmol；而体内试验结果表明无论是腹腔内还是静脉内给予5-FC，都同样观察到明显的抗肿瘤效应。

　　Richard等[9]将组织特异性因子癌胚抗原（CEA）转录调控序列的三个部分分别插入到含CD基因的pCMV/CD-1中，构建了一系列pCEA/CD基因载体，通过分析荧光素活性，筛选出活性最高的pCEA/CD-145基因。体外实验将其转导入大肠癌NCIH508细胞中，在5-FC存在下，基因表达发挥出良好的原药转换抗肿瘤效应，CD+的NCIH508细胞其IC50＜2μmol，而CD－的NCIH 508细胞其IC50达516μmol。体内实验比较转导前后的大肠癌细胞裸鼠体内成瘤后，给予5-FU500μg(kg·d，），连续20日，细果显示未转导CD的大肠癌细胞成瘤裸鼠肿瘤重量增加了近3倍，而转导CD的大肠癌细胞成瘤裸鼠肿瘤重量基本未改变。

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　　肝肿瘤　肝原发或继发肿瘤的基因治疗研究报道最多。由于肝脏是结肠癌最常转移的部位，因此，Ohwada等[17]在建立结肠癌肝转移动物模型的基础上，给予人结肠癌荷瘤裸鼠肝内注射AdCMV.CD和腹腔内每周二次给予5-FC，以点杂交分析肝内人结肠癌细胞DNA数量来判断抑制转移瘤效果。结果与对照组相比，治疗组肝内人结肠癌细胞DNA数量显著低于各对照组，级组织学检查显示治疗组注射部位肝肿瘤出现坏死，对照组未见此现象，且治疗组中正常肝组织仅见轻微的、可恢复的炎症，未见坏死。

　　最近，Kanai等[18]报道选择甲胎蛋白（AFP）启动子/增强子，构建重组腺病毒载体AdAFP-CD和AdAFP-Lac z，分别转染AFP+的肝癌细胞系和AFP-的肝癌细胞系，结果显示：在前者，目的基因转移效率显著提高，5-FC的IC50为136.6μmol，而后者的IC50达24651μmol。

　　胰腺癌　癌基因ERBB2在多种肿瘤尤其在胰腺癌、乳腺癌等肿瘤组织中呈高表达，而在正常和炎症胰腺组织未见这种高表达，因此，Harris等以ERBB2转录调节序列中一含544个碱基对的DNA片段启动CD基因，选择逆转录病毒载体转染胰腺癌细胞HPAF、Panc1和乳腺癌细胞T3M4，HPAF细胞呈高表达、Panc 1细胞呈中度表达、而T3M4细胞不表达ERBB2。检测结果表明未转染的上述三种细胞检测不出CD酶活性，而转染后其CD酶活性分别为每分钟958.3、344.5和0 pmol/109(每分钟109细胞产生尿嘧啶的微摩尔量）。在前两组，给予5-FC后，转染CD的胰腺癌细胞生长明显受抑，而在T3M4组，细胞生长则未见明显改变。近来，Evoy等[14]报道选用腺病毒载体，成功将CD基因转染胰腺癌细胞，同样在体内、体外观察到明显的抗肿瘤效应。

　　胃癌　大约40%的胃癌表达CEA，Lan等[20]采用CEA启动子作为靶向性因子，构建了重组病毒载体AdCEA-Lac z和 AdCEA-CD，分别转染CE A阳