一种新型海洋来源的蒽环类化合物D19抗肿瘤活性(2)

　　将MCF-7细胞消化后计数，按每孔1.0×105个细胞分别接种至已铺有盖玻片的24孔细胞培养板中，24 h后用0.1 μmol/L D19处理细胞。将50 μL terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)反应缓冲液加至细胞上，将培养板置于湿盒中于37 ℃避光反应60 min。吸弃反应液，加入2×SSC室温作用15 min，用PBS洗涤3次，每次5 min。加入1 μg/mL PI 避光作用15 min，再用PBS洗涤3次，每次5 min。最后将盖玻片上的细胞避光干燥过夜，次日加Anti-Fade封片。在荧光显微镜下进行观察并拍照保存图片，TUNEL染色阳性荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒为Promega公司产品。

　　2.4Western Blotting检测相关蛋白

　　收集得到不同浓度梯度处理的细胞裂解液，按BCA法进行蛋白定量(美国Pierce公司)。电泳后，转膜到PVDF膜上，固定后常温孵育3 h或4 ℃过夜，鼠抗人caspase-9(美国BD Biosciences公司);兔抗人PARP(美国Cell Signaling Technology公司);α-tubulin(美国Sigma公司)，再孵育相应二抗(美国Pierce公司)，最后在暗房用ECL显色液(美国Pierce公司)显色发光。

　　3结果

　　3.1D19对乳腺癌细胞的抑制作用

　　D19 对人乳腺癌细胞MCF-7和 MDA-MB-435的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖性，对低分化、高侵袭性的乳腺癌细胞MDA-MB-435抑制率最高，对低致瘤性、对低转移的人乳腺癌MCF-7抑制率其次(见图1)。其作用48 h的半数生长抑制浓度(IC50)分别为4.01 μmol/L和7.32 μmol/L。[PSa6691;S*2〗图1D19对人乳腺癌细MCF-7和MDA-MB-435作用48 h 的剂量-抑制效果Figure 1The dose-dependant proliferation inhibition effect of D19 in human breast cancer cell lines,MCF-7 and MDA-MB-435 were treated with the indicated concentrations for 48 hD19处理48 h后，MCF-7、MDA-MB-435细胞密度较对照组明显降低，随着药物浓度的增加，细胞密度进一步显著降低。在光学显微镜下放大200倍可观察细胞出现典型的细胞凋亡形态学变化，贴壁细胞开始出现体积变小、变形、皱缩、变圆、脱落(见图 2、 3)。[PSa6692;S*2〗图2人乳腺癌 MCF-7细胞经不同浓度的 D19作用 48 h 后的形态学变化(200×)Figure 2Morphological changes of MCF-7 human breastcancer cells treated with indicated concentrations of D19 after 48 h (200×)

　　3.2D19抗肿瘤活性的机制

　　3.2.1TUNEL检测D19 诱导乳腺癌细胞凋亡的结果人乳腺癌细胞 MCF-7经 16 μmol/L 的D19 作用 24 h后，出现大量 TUNEL 染色阳性的细胞，而对照组未经D19 作用的细胞基本未见 TUNEL 阳性出现(见图4)。在荧光显微镜下任意选取10个视野对TUNEL阳性细胞进行计数，统计得到D19作用组的TUNEL阳性细胞数比对照组高达70倍(见图5)。结果表明，D19的作用能够有效诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡。D19对MDA-MB-435细胞处理的结果相类似。[PSa6693;S*3〗图3人乳腺癌 MDA-MB-435细胞经不同浓度的 D19作用 48 h 后的形态学变化(200×)Figure 3Morphological changes of MDA-MB-435 human　　breast cancer cells treated with indicated concentrations of D19 after 48 h (200×)[PSa6694;S*2〗图4TUNEL检测D19诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡的结果 (100×,c/16 μmol·L-1,24 h)　Figure 4TUNEL detected the effect of D19 induces apoptosis in MCF-7 (100×,c/16 μmol·L-1,24 h)[PSa6695;S*2〗与对照组比较：**P<0.01图5D19作用于乳腺癌细胞MCF-7的TUNEL阳性细胞定量 (24 h)Figure 5TUNEL positive cells quantification after treated by D19 on MCF-7

　　3.2.2D19作用后乳腺癌细胞中凋亡蛋白表达水平的变化