论补肾生精法对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响
2013-12-10 01:06
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摘要： 【目的】观察补肾生精法对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影
摘要： 【目的】观察补肾生精法对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响。【方法】 选用20只22月龄老龄雄性SD大鼠随机分为2组，每组10只，分别为空白对照组和补肾生精组；补肾生精组给药剂量为0.05g·kg-1·d-1，连续灌胃给药60d。取大鼠右侧睾丸，采用双向凝胶电泳法分析空白对照组和补肾生精组大鼠睾丸差异表达蛋白。【结果】与空白对照组比较，补肾生精组大鼠睾丸中有7种蛋白表达发生了显著变化，其中4种蛋白表达上调，3种下调。对7种差异表达蛋白点胶内酶切后进行质谱分析，其中5种蛋白分别鉴定为磷脂酰乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine瞓inding protein, PEBP）、热休克蛋白8 (heat shock 70 kDa protein 8，HSP7C)、磷酸丙糖异构酶(triose瞤hosphate isomerase，TPIS)、3擦姿岣视腿┩亚饷福╣lyceraldehyde3瞤hosphate dehydrogenase ，GAPDH）、谷胱苷肽睸不转移酶1（glutathione S瞭ransferase Mu 1 ，GSTM11）。【结论】补肾生精法延缓衰老的作用可能与其能调节老龄大鼠睾丸蛋白表达有关。
关键词： 补肾生精法/治疗应用； 衰老/中药疗法； 蛋白质组； 疾病模型，动物； 大鼠
睾丸功能的减退与男性衰老之间存在着重要的联系。近来多项研究表明，从50岁开始，随着年龄的增长，男性由于睾丸雄激素合成功能逐步衰退而引起一系列的临床综合征称为中老年男性部分雄性激素缺乏综合征（PADAM）［1］。
中医学认为肾虚是衰老的主要原因，现代研究也证明肾虚与衰老密切相关，补肾方药确有延缓衰老作用［2-3］。为了探讨补肾生精方药延缓衰老的机理，我们应用蛋白质组学技术，观察了补肾生精颗粒对老龄大鼠睾丸蛋白表达谱的影响。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 固相 pH梯度(immobilinepHgradient,IPG)胶条、尿素、硫脲、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、蛋白质相对分子量标记、3玻3玻ǖ酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（CHAPS）、胶条缓冲液(IPG buffer)、凝胶条覆盖液、胶槽清洗液、过硫酸胺(APS ),十二烷基磺酸钠(SDS）均购自Amersham biotech公司;复合蛋白酶抑制剂(proteasein hibitorco cktail）购自Pierce公司；碘乙酞胺、体积分数37%甲醛溶液、三氟乙酸（FA )、乙腈(ACN )均购自Sigma公司;胰蛋白酶购自Promega公司；低熔点琼脂糖、硫代硫酸钠、牛血清白蛋白(BSA )均购自上海生工公司; 乙酸、无水乙醇、甲醇、硝酸银、无水碳酸钠、乙二胺四乙酸钠(EDTA睳a )、考马氏亮蓝R250、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸均为国产分析纯。等电聚焦系统（IPG瞤hor）、GS800凝胶成像仪、 ImageMaster 2D platinum software 5.0 软件均由美国BIO睷AD提供； 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 （MALDI睺OF，AMERICA APPLY SYSTEM）。
1.2 药物制备 补肾生精颗粒主要由菟丝子、枸杞子、淫羊藿等组成，由广东省中医院制剂室提供（批号：06071802）。配成浓度为50mg/L混悬液，灭菌后4℃保存备用。
1.3 动物及分组 选用22月龄老年雄性SD大鼠20 只（购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：医动字06493），随机分为2组，每组各10只，分别为空白对照组（灌喂等容积生理盐水）和补肾生精组（给药剂量为0.05g·kg-1·d-1），连续给药2个月。
1.4 蛋白抽提与定量 以30g/L戊巴比妥 20mg/kg腹腔注射麻醉动物；取大鼠右侧睾丸，剥去白膜，迅速置于液氮中，研碎；加入适量蛋白抽提试剂［8mol/L 尿素、0.2g/L CHAPS、20 mmol/LDTT、1 mmol/L EDTA，1 mmol/L苯甲基磺酸氟（PMSF） 以及蛋白酶抑制剂混合物］；震荡溶解后，室温孵育1 h，离心(4℃、12 000 g) 15 min，取上清，分装保存于-70℃冰箱；蛋白定量采用Bradford 法。
1.5 双向电泳 选取pH值为3～10的线性IPG胶条，采用IPG瞤hor System 进行第一向等电聚焦。取1mg蛋白，溶于重泡胀液(8 mol/L 尿素、0.2g/L CHAPS、0.02 mol/L DTT、0.5g/L IPG 缓冲液)；将聚焦后的胶条在SDS 平衡液(6 mol/L 尿素，20g/LSDS，1.5 mol/L Tris睭Cl、pH 8.8，体积分数30% 甘油)中平衡2次(摇床上振荡)，每次15 min。其中，第1次平衡液中加入20 mmol/L DTT，第2次平衡液中加入100 mmol/L 碘乙酰胺；取出胶条在PROTEN II xi Cell 上进行垂直方向的第二向电泳，即SDS簿郾烯酰胺凝胶电泳，恒流40 mA，40 min；置固定液(乙醇和乙酸的混合水溶液，含体积分数40% 乙醇、10% 乙酸)中固定30 min；用1g/L 考马斯亮蓝染液R250进行凝胶染色3 h，脱色过夜。
