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正常和6掺嵌喟桶坊偎鸫笫蠼徘藕松窬元对胆碱能(2)

2014-01-17 01:12 并结合原始放电序列，将神经元的放电形式分为以下3种类型：①规则放电：ISIH呈对称分布;②不规则放电：ISIH呈随机不对称分布;③爆发式放电：ISIH呈逐渐衰减的正偏态分布。每一个ISIH的生成最少包含500个连续的动作电位，bin宽4ms。另外，根据ISIH计算出平均放电间隔的变异系数。变异系数是放电间隔的标准差与平均放电间隔之比，反映神经元电活动的规则程度[3,7]。

　　1.4 局部给药 PPN内微量注射使用与1μL微量注射器相连接的玻璃微电极，微电极尖端直径约50μm。将给药微电极和记录微电极固定于微电极操纵器上，调整两个电极使其尖端的位置非常接近(小于0.4mm)。核团内微量注射药物或盐水的剂量均为200nL，约3min注完。一般情况下，微量注射的机械作用会引起神经元的放电幅度降低，这种作用约持续1min。因此，在统计数据时，微量注射后1min内的放电活动不予计算。每个神经元在给药前记录5min自发放电作为前对照，给药1min后记录5～10min以观察给药后神经元电活动的变化。与前对照相比，放电频率的改变超过20%则认为有显著性变化。每只大鼠只观察1个神经元对药物的反应。

　　1.5 组织学及免疫细胞化学 电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳滂胺天蓝(-20μA，15min)标记最后一个记录位点。大鼠在过量麻醉后，经心脏灌注生理盐水，随后用40g/L多聚甲醛灌注固定;取脑后固定4h;再将鼠脑置于含200g/L蔗糖的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中过夜;连续冠状冰冻切片，片厚40μm，行尼氏染色以确定记录神经元的位置。

　　为确认多巴胺能神经元的损毁程度，将大鼠SNc的脑片行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)染色[7]。先将脑片在室温条件下置于含3g/L TritonX100中30min;然后置于含30g/L牛血清蛋白的PBS中室温30min;接着加入一抗(1∶800，Chemicon，美国)，在4℃条件下孵育48h;加入生物素标记的二抗(1∶200，Chemicon，美国)室温孵育2h;再加入抗生物素蛋白采物素过氧化物酶复合物(1∶100，Vector，美国)室温孵育2h;

　　最后将脑片置于含0.1mL/L H2O2的0.5g/L DAB显色剂中室温下显色5～10min。除加入一抗外，其他步骤之间均需漂洗。最后，将脑片裱于明胶处理过的载玻片上，待自然干燥后，常规酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。显微镜下行TH阳性细胞计数。在6睴HDA毁损组，只有注射侧SNc内TH阳性神经元完全或几乎完全缺失的大鼠进行电生理资料统计。

　　1.6 数据统计与分析 两组间或组内放电频率的比较采用Student餾 t检验，PPN神经元对Oxo睲不同反应的百分比及神经元放电形式的比较采用χ2检验。平均放电间隔和变异系数的比较采用Mann瞁itney U检验。所有数据均以

　　±s或对照的百分比表示。定义P<0.05为显著性差异的标准。

　　2 结 果

　　尼氏染色结果证实，所有正常和6睴HDA毁损组大鼠通过滂胺天蓝电泳标记的记录位点均位于PPN内(图1A)。本研究中的6睴HDA毁损组大鼠在阿朴吗啡诱导旋转实验中均表现出恒定的向损毁侧的对侧旋转，且5min内旋转圈数均超过20圈[34±3(圈/5min)]，这些大鼠在TH染色后毁损侧SNc内多巴胺能神经元均完全消失(图1B)。

　　2.1 正常组和6睴HDA毁损组大鼠PPN神经元的电活动 在正常组的28只大鼠中，PPN神经元放电频率的变化范围是1.0～19.3spikes/s，平均为(8.1±1.1)spikes/s(n=28，图2A)。平均放电间隔为(263±71)ms，平均变异系数为0.37±0.05(图2B、2C)，大多数PPN神经元(61%)呈现出规则放电，32%的神经元为不规则放电，7%的神经元为爆发式放电(图2D)。在6睴HDA损毁组的33只大鼠中，PPN神经元放电频率的变化范围是1.2～49.7spikes/s，平均放电频率为(13.1±2.2)spikes/s，与正常组相比明显增加(n=33，P<0.01;图2A)。平均放电间隔

　　图1 6睴HDA损毁大鼠脚桥核内标记的记录位点和TH免疫组化染色显示6睴HDA注射侧黑质致密部内多巴胺能神经元完全变性

　　Fig.1 Nissl staining showing location of the recording in the PPN of the 6睴HDA瞝esioned rats. TH immunocytochemical staining showing the total degeneration of dopaminergic neurons in the SNc on the 6睴HDA injected side compared to the normal side.

　　A：脚桥核内标记的记录位点(箭头所指为记录位点);B：右侧黑质致密部内多巴胺能神经元正常，左侧完全变性。标尺：A=0.5mm，B=2mm。

　　为(106±15)ms，与正常组相比明显降低(P<0.02，图2B)。平均变异系数为0.63±0.04，与正常组相比显著升高(P<0.001，图2C)，提示6睴HDA毁损组大鼠PPN神经元的放电形式与正常组相比不规则程度增加。从PPN神经元各种放电形式所占百分比可以看出，6睴HDA损毁组大鼠PPN神经元的放电形式明显趋于不规则;规则放电神经元的百分比减少到21%，而不规则放电神经元增至64%(P<0.001);另有15%的神经元表现出爆发式放电(图2D)。

　　2.2 Oxo睲对正常组和6睴HDA损毁组大鼠PPN神经元电活动的影响 在6只正常大鼠PPN内注射200nL盐水作为实验对照。盐水注射前和注射后PPN神经元的平均放电频率分别为(11.5±2.2)spikes/s和(12±2.3)spikes/s，