柴胡疏肝散抗肝纤维化的实验研究论文(2)
2014-12-07 01:38
导读：132 病理检测 组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔
132 病理检测 组织芯片分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，并根据王泰龄等改进的肝纤维化半定量评分系统(SSS)〔3〕进行炎症活动度及肝纤维化程度计分。
133 免疫组织化学检查α睸MA、TGF拨1 采用石蜡包埋常规切片,SP法,兔抗鼠TGF拨1,多克隆抗体及鼠抗鼠α睸MA单克隆抗体均以1∶100 稀释,DAB 显色,苏木素复染。PBS 代替一抗作为阴性对照。阳性组织呈棕色，阴性组织呈蓝色痹谌自动图像分析系统上，采用HPIAS2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片10个视野(×400)倍测定阳性细胞的A值与所占视野面积，取其乘积平均值为该组织切片所得值，两项乘积越大表明组织中该抗原含量越高。
134 RT睵CR检测 大鼠GAPDH 上游引物:5′睠ATGACCACAGTCCATGCCATC3′,下游引物：5′睠ACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC3′全长450 bp；TGFβ1 上游引物：5′睺GAGTGGCTGTCTTTTGACG3′，下游引物：5′睞CTTCCAACCCAGGTCCTTC3′全长350 bp。α睸MA上游引物：5′睞AGAGGAAGACAGCACAGCTC3′,下游引物：5′睪ATGGATGGGAAAACAGCC3′称取50～100 mg 肝组织用Trizol 提取总RNA，采用分光光度法测定其含量及纯度，测定A260/A280 值。取2 μg 总RNA，42 ℃逆转录90 min。参数设置94 ℃变性,3 min ×1 循环。94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环。最后72 ℃彻底延伸7 min ×1 循环。同法扩增GAPDH 作为内参照。取5 μl PCR 产物15%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测灰度,TGF拨1/GAPDH 比值表示TGF拨1 mRNA 相对水平。α睸MA/GAPDH 比值表示α睸MAmR2NA 相对水平。
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统计学分析 实验结果计量数据以x±s表示，经SPSS1110软件包进行方差分析，组间比较采用t检验。
2 结果
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