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高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物对小鼠免疫功能的(2)

2015-08-22 01:09

　　1.3.6  NK细胞杀伤毒性实验［8］　

　　用含10%小牛血清的RIMP1640培养液脾细胞悬液配成1×107/ml浓度作为效应细胞；传代培养的L929细胞在实验前1 d换液，实验时用0.25%胰蛋白酶1～2 ml消化1～2 min，加完全RIMP1640培养液，吹打使其完全从壁上脱落，离心去上清，加含小牛血清的培养液，调至浓度为2×105/ml,作为靶细胞;在96孔板内加入靶细胞悬液，每孔0.1 ml，放入37℃，5%CO2孵箱中培养1 h，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入0.1 ml效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全RIMP1640培养液0.1 ml；然后将96孔板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育20 h，去上清用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分；每孔加入0.1 ml的0.1%中性红染液，孵育30 min，弃去染液，用生理盐水洗3遍，每孔加0.1 ml细胞溶解液，使含有中性红的靶细胞溶解，摇匀，用酶标仪测OD值，波长450 nm，用以下公式计算杀伤率。实验数据采用方差分析检验 。

　　杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)靶细胞OD值×100%

　　2  结果

　　2.1  水解液的成分分析在以上确定的最佳条件下水解得到的水解液呈淡黄色透明状态，氨基酸分析结果见表1。表1  水解液的游离氨基酸和总氨基酸的分析（略）

　　2.2  T淋巴细胞转化实验结果见图1。结果显示，与对照组相比，不同剂量组酶解产物对小鼠脾T淋巴细胞增殖活性均有一定影响，存在明显的剂量依赖关系，其中在浓度较低（低剂量组）时，对淋巴细胞增殖活性的调节作用很小，随着添加浓度的增大，作用逐渐明显，当浓度为 0.4 g/ kg（高剂量组）时，增殖作用达到最大，与正常对照组比较 ，差异有显著意义（P＜0.05）。

    从表1可见，高原鼢鼠肉蛋白水解液含8种必需氨基酸在内的17种氨基酸，且必需氨基酸占总氨基酸量的46.58%，说明高原鼢鼠肉水解后其必需氨基酸数量充足，组成比例较为合理，符合FAO/WHO建议的人体必需氨基酸模式；E/N=0.92，大于 FAO/WHO推荐的0.6；高原鼢鼠水解液中含有较高量婴幼儿所需的组氨酸和精氨酸，所以高原鼢鼠肉水解液是一种优质蛋白液；由于其中氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等)的含量较高，占氨基酸总量的26.11%，故水解液味道非常鲜美。

　　2.3   酶解液对小鼠抗体生成脾细胞数(ＩｇM-PFC)的影响图2显示，各组小鼠脾脏的抗体生成细胞数依次升高，其中，酶解液高剂量组、中剂量组与对照组比较，差异具有显著性意义 (P＜0.05)，说明酶解液具有增强小鼠特异性体液免疫的功能。

    图3显示，酶解液低剂量组、酶解液中剂量组、酶解液高剂量组与生理盐水组比较，NK杀伤率均有提高；其中，酶解液低剂量组、酶解液中剂量组、与生理盐水组比较，差异具有显著性意义 (P＜0.05)；酶解液高剂量组与生理盐水组比较，差异具有极显著性意义 (P＜0.01)，说明高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解液能提高机体免疫力。

　　3  讨论

    高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解产物是氨基酸与多肽的混合物，酶解能改变蛋白质的功能特性，如酶解能大大提高其溶解性；一定程度的水解也能提高其乳化性等，肽作为动物消化道蛋白质的酶解产物，是被迅速吸收的氨基酸供体，能够调节动物体消化、神经、内分泌和免疫等系统的生命活动，这类物质被称为腔内信号分子，随着肽吸收理论为越来越多的人们接受，活性肽在动物蛋白质营养中的作用愈发受到关注，因而有人提出蛋白质的营养是肽的营养。

    机体免疫功能特别是细胞免疫功能下降，是导致细菌和病毒感染等发病率高的主要因素，体外淋巴细胞转化实验是目前测定机体细胞免疫功能状态的一种较好的方法［9］。

    自然杀伤细胞（NK细胞）是一类重要的免疫调节细胞，是机体细胞免疫功能的组成部分，能非特异性地杀伤靶细胞，参与细胞免疫，在肿瘤免疫、抗病毒感染中也具有重要作用，其介导的细胞毒性作用是肿瘤细胞免疫监视的第一道防线，因而，NK细胞在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视，是目前已被公认的免疫监视中最重要的效应细胞。因此，研究生物活性物质对 NK细胞杀伤活性的影响有重要意义。

    对T-细胞依赖的抗原SRBC的抗体反应是体液免疫能力的体现，它是免疫力分析中最敏感和最优先的参数［10］，体内对SRBC的抗体反应，是反映了增加抗原细胞、T-细胞、B-细胞之间协同能力的免疫反应。

    本实验为了综合开发利用高原鼢鼠资源，探讨高原鼢鼠肉酶解液对小鼠免疫功能的影响，变害为宝，提高高原鼢鼠肉蛋白的营养和利用价值，采用酶法水解高原鼢鼠肉得到的酶解物，针对免疫系统中T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的免疫学实验。实验表明酶解物具有增强细胞免疫活性、体液免疫活性及NK细胞杀伤毒性的能力。

【参考文献】

  　　［1］黄鹂虹. 大豆多肽的生理功能及应用［J］.食品科技， 1999，3：50.

　　［2］魏登邦，张宝琛. 高原鼢鼠肉抗缺氧成分的筛选［J］.中国兽医科技，2003，33（2）：56.

　　［3］魏登邦，张宝琛.高原鼢鼠肉脂溶性物质的抗缺氧效果与化学成分［J］.动物学报　2002，8(6)：764

　　［4］刘海春，魏登邦. 高原鼢鼠肉脂溶性物质抗缺氧机制的探讨［J］.黑龙江畜牧兽医，2003，4 ： 7.

　　［5］魏登邦,张宝琛. 高原鼢鼠肉脂溶性部分的抗氧化效果［J］.黑龙江畜牧兽医，2002，7：1.

　　［6］潘 明，侯若彤，王晓峰，等. 高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶水解工艺研究［J］.四川大学学报（工程科学版）2005，37(3):68.

　　［7］杜念兴. 兽医免疫学［M］.北京: 中国农业出版社，1995：210.

　　［8］陈 奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1994∶753.

　　［9］何 岚 . 抗肿瘤中药复方免疫调节作用的实验研究思路，ACMP，2003，31（5）：16.

　　［10］Barlow . Injectable hormone contraception and bone density: results from a prospective study［J］. Epidemiology， 2002,13(5)：581.

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