高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物对小鼠免疫功能的

               作者：潘明， 赵弋清，侯若彤，刘素君，杨志荣

【摘要】  目的研究高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物生理活性功能，对酶解物进行了免疫活性实验。方法通过MTT法和中性红比色法测定其对小鼠脾淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬功能、网状内皮系统吞噬功能、NK细胞杀伤毒性，鼠抗体生成脾细胞数(IgM睵FC) 的影响。结果酶解物高、中剂量与对照相比有显著差异，而其中以高剂量组的活性最明显，能够显著提高小鼠淋巴细胞的增殖能力；激活小鼠网状内皮系统，增强吞噬功能；增强NK细胞活性；增加小鼠脾脏的抗体生成细胞数。结论 高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物能明显提高正常小鼠细胞免疫、体液免疫及NK细胞杀伤毒性的能力。

【关键词】  高原鼢鼠肉；木瓜蛋白酶； 酶解；免疫功能

　　Abstract：Objective In order to investigate the physiological funtions of  papain digest of Myospalaxbaileyi flesh protein, immune activity experiment was done with the digest. MethodsMTT method and neutral red colorimetric method were applied to measure the effect of the digest on the proliferation of spleen lymphocyte of mice, the phagocytic function of celiac macrophage and reticuloendothelial system, the killing toxicity of NK cells, and the number of splenocyte induced by rat antibody (IgM睵FC). ResultsThe groups with high and middle dosage have significant difference from the control group, with the high dosage group showing the most obvious activity. ConclusionThe papain digest of Myospalaxbaileyi flesh protein has a significant promotion effect on the cell and humoral immunity of normal rat as well as the killing and toxicity activity of NK cells.

　　Key words：Myospalax baileyi meat；  Papain；  Hydrolysis；  Immune function

    高原鼢鼠Myospalax  baileyi是栖息于青藏高原的一种危害草场和农田的数量巨大的地下啮齿动物。据营养成分的分析结果（《四川动物》待发），高原鼢鼠肌肉除含有亚油酸等对人体有益的不饱和脂肪酸外，还有丰富的蛋白质,钙、镁、铁、锌、磷等无机盐和烟酸、核黄素、视黄醇等维生素，是一种营养价值很高的蛋白质资源。近年的研究表明，蛋白质水解为小肽后就可以被人体吸收［1］，而蛋白质水解产物具有蛋白质无法比拟的生理功能和营养价值。近几年对高原鼢鼠肉的研究集中在脂溶性成分抗缺氧机制上［2～5］，目前尚未见对高原鼢鼠肌肉蛋白酶解液免疫功能的相关研究报道。

    为了综合开发利用高原鼢鼠资源，变害为宝，提高高原鼢鼠肉蛋白的营养和利用价值，本研究采用酶法水解高原鼢鼠肉，对酶解液的氨基酸成分进行了分析，并针对免疫系统中T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，进行了T淋巴细胞转化实验、小鼠抗体生成脾细胞数(IgM-PFC)、NK细胞杀伤毒性实验等免疫学实验，探讨高原鼢鼠肉酶解液对小鼠免疫功能的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与试剂

　　1.1.1  材料 

　　高原鼢鼠Myospalax  baileyi：捕于四川省阿坝州若尔盖县。

　　1.1.2  试剂

　　木瓜蛋白酶5.8×105 U/g，美国Sigma公司产品；RIMP1640培养基，美国GIBCO公司产品；MTT，ConA，LPS；Alsever溶液；Hank's溶液；0.8%戊二醛溶液；1.51%绵羊红细胞悬液。其它试剂：市售，均为分析纯。

　　1.1.3  动物  

　　昆明种健康成年小鼠，雌雄各半，体重20～22 g，由四川大学华西实验动物中心提供。

　　1.2  仪器与设备

　　DS1高速捣碎机(上海标本模型厂)； KMTD500型电热恒温震荡水槽(上海益恒实验仪器有限公司)；LD510型离心机(北京医学仪器厂)；  KQ400超声波发生仪(昆山市超声仪器有限公司)；Phs2 c型pH计(上海虹益仪器厂)； 751睪型紫外光栅可见分光光度计(上海分析仪器厂)等。

　　1.3  方法

　　1.3.1  酶解液制备［6］高原鼢鼠Myospalax  baileyi 肉木瓜蛋白酶解液，酶解液100℃煮沸10 min，冷却至室温，以10 000 r/min，离心5 min，收集上清液。残渣再重复提取两次，合并3次的上清液，静置，分去油脂后真空浓缩，真空干燥得酶解高原鼢鼠肉蛋白，密封冷藏。

　　1.3.2  酶解液氨基酸分析

　　采用日立83550型氨基酸分析仪进行测定。

　　1.3.3  脾细胞悬液的制备将上述昆明小鼠40只，随机分为正常组、酶解物大、中、小剂量组，每组10只，连续灌胃7 d，颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取脾，置于盛有无菌 Hank’s液的小平皿中撕碎，在200目不锈钢筛上轻轻研磨过网，用无菌Hank's液洗3次，离心10 min/次(1 000 r/min）。将细胞悬浮于2 mlRIMP1640培养液中，用台盼兰染色检查细胞成活情况，选择成活细胞在95%以上者进行实验。调整细胞浓度为2×105个/Ｌ。

　　1.3.4  T淋巴细胞转化实验［7］将细胞悬液分两孔加至24孔培养板中，1 ml/孔，一孔加ConA液50 μl(相当于5 mg/ml)，另一孔作为对照，置5%CO2，37℃条件下培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸去上清液0.7 ml，加入不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT50 μl/孔(5 mg/ml)，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 ml酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，在波长570 nm处测定吸收度。

　　1.3.5  对小鼠抗体生成脾细胞数(IgM睵FC)的影响： 给药途径、剂量及方法同1.3.3项。处死前5 d，每只小鼠腹腔注射生理盐水配制成的20 ml/L SRBC 0.2 ml(约2×108个)。将经SRBC免疫5 d的小鼠处死，取出脾，放在盛有HankS液的小平皿内，轻轻撕碎脾，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心洗净，将细胞悬浮在5 ml RIMP1640培养液中，调节至细胞浓度为5×106个/ml，取20 μl脾细胞悬液、50 μl含100 ml/L SRBC的SA液及0.5 ml处理的表层琼脂糖培养液，混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入CO2培养箱温育1.0～1.5 h，然后将SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加入到玻片架的凹槽内，继续温育1.0～1.5 h，形成肉眼可见的空斑后计数溶血空斑数。测定每5×106个脾细胞产生的空斑数。

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